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第五章 分子发光分析法 第一节 荧光与磷光的基本原理 第一节 荧光与磷光的基本原理 非辐射能量传递过程 辐射能量传递过程 第一节 荧光与磷光的基本原理 第一节 荧光与磷光的基本原理 第一节 荧光与磷光的基本原理 第一节 荧光与磷光的基本原理 第一节 荧光与磷光的基本原理 第一节 荧光与磷光的基本原理 第一节 荧光与磷光的基本原理 第二节 荧光分析法与磷光分析法 第二节 荧光分析法与磷光分析法 第二节 荧光分析法与磷光分析法 第二节 荧光分析法与磷光分析法 第二节 荧光分析法与磷光分析法 第三节 化学发光分析法 第三节 化学发光分析法 第三节 化学发光分析法 第三节 化学发光分析法 第三节 化学发光分析法 第三节 化学发光分析法 第三节 化学发光分析法 第三节 化学发光分析法 第三节 化学发光分析法 第三节 化学发光分析法 三、荧光（磷光）强度与溶液浓度的关系 相应的吸光分数为： 荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比： 按照级数展开式： 三、荧光（磷光）强度与溶液浓度的关系 对于稀溶液，当? bc0.05（磷光? bc0.01）时： IF----荧光强度 ?F-----荧光效率 k--与仪器灵敏度有关的参数 I0--入射光强度 IP----磷光强度 ?P-----磷光效率 b--吸收光程 ?--摩尔吸光系数 C--荧光物质浓度 荧光定量分析依据 磷光定量分析依据 三、荧光（磷光）强度与溶液浓度的关系 注：高浓度时，If ＝ KC不成立 If C 原因： （1）高次项 （2）猝灭效应 荧光猝灭：荧光分子与溶剂分子或其 它 溶质分子相互作用引起荧光强度降低或 消失的现象。 荧光猝灭剂：这些溶剂分子或其它溶质 分子称为荧光猝灭剂。前面提到的氧分 子及重原子效应都是常见的荧光猝灭剂。 荧光自猝灭效应：由荧光物质自身引发的 荧光强度减弱的现象叫荧光自猝灭效应 常见的自猝灭现象有两种：一是当荧光物质发出的荧光通过溶液时被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。另一种是由于激发态分子之间的碰撞，导致费辐射跃迁概率的增大，荧光效率降低。 四、激发光谱与荧光（磷光）光谱 荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，可根据它们的激发光谱曲线来确定。 绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波长的关系，即可绘制激发光谱曲线。 如果 固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定所发射的不同的波长的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光光谱曲线。 四、激发光谱与荧光（磷光）光谱 四、激发光谱与荧光（磷光）光谱 一、荧光分析法 光源 样品池 激发 单色器 检测器 数据处理 仪器控制 发射 单色器 1、仪器设备 由光源、单色器、液槽、检测器和信号显示记录器五部分组成。 与分光光度计的主要差别： 采用垂直测量方式，即在激发光相垂直的方向测量荧光，以消去透射光影响。 有两个单色器，一个置于液槽前，用于获得单色性较好的激发光；一个置于液槽后，用于分出某一波长的荧光，消除其他杂散光干扰。 一、荧光分析法 1）光源 光源的要求：比吸收测量中的光源有更大的发射强度。 氙灯光源：波长范围：250~800nm连续光谱。是应 用最广泛的光源。 常用荧光分析光源： 氙灯 ，高压汞灯。 高压汞灯光源：光谱略呈带状，荧光分析中常用 365.0，405，436nm三条谱线。 2）单色器：平面衍射光栅。 3）检测器：光电倍增管。 一、荧光分析法 2、特点 优点：1）灵敏度高，比紫外-可见分光光度法高2～4个数 量级。 2）选择性强，既可依据特征发射光谱，又可根据 特征吸收光谱； 3）试样用量少。 缺点：应用范围相对小。 一、荧光分析法 3、应用 1）无机化合物的分析 ①利用无机离子与一些有机化合物形成有荧光的络合物，对其进行荧光检测。目前采用有机试剂进行荧光分析的元素已近70种。能够同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物。荧光分析中常用的另一类络合物是三元离子络合物。 ②荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法。 2）有机化合物的分析 ①脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发生荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。 ②芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光，可直接用荧光法测定。 3）生命与生物物质的分析 一、磷光光分析法 1、仪器设备 与荧光分析仪器相似，也是由光