elisa免疫测定课件.ppt

ELISA的概念 ELISA属于标记免疫学技术的一种，1971年由荷兰和瑞典的学者提出，操作过程简单易行并可以定量，从而使其在免疫学检测中得到了广泛的应用。 标本采集、保存 溶血标本及混有红细胞的血清易产生假阳性,因溶血血清中含有过氧化酶,造成假阳性 受细菌污染因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶,造成假阳性 在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深,造成假阳性 EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性,造成假阴性 标本凝固不全,形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果 标本中有内源性干扰物, 不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和其他物质等 定量测定的结果判定是每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线，根据标本的吸光度值不同来确定待测物的浓度。 在间接法和夹心法ELISA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。 灰区概念 把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告+（阳性）。 酶标仪单、双波长检测的比较  酶标仪是垂直光路测定吸光度。垂直光的特点是样本吸光度受液体浓缩或稀释的影响小，不足之处是易受被测样本液面是否水平，酶标板透光性孔底是否平整等的影响较大。 酶标仪在用单波长测定吸光度时，受到测定干扰（样本的浊度、干扰色等）、电路干扰（包括噪音、漂移、电压等）和液体表面张力的影响也很大。 双波长的测定时采用两个不同波长(测定波长450和参比波长630)同时测定一个样品的吸光度，它们的差值是样品相对准确的吸光度，这样就会减少了测定干扰和电路干扰。 双波长差吸光度法具有可以克服一些外界环境的影响共存组分吸收谱叠加的干扰，以及减少比色的光学不均一性等特点，吸光度在一定的范围内有良好的线性关系。 双波长测定明显比单波长更适合于生物活性测定实验，其可以提高实验结果分析的准确度，减少实验误差。 结果的解释 乙肝五项的结果解释 1,3,5或1,3 大三阳 1,4,5或1,5 小三阳 全阴或Sb阳性 除此之外一律复查 丙肝抗体ELISA检测试剂现已发展至第三代试剂，第三代试剂的灵敏度和特异性比前两代试剂都高。第一代试剂利用来自HCV病毒基因组中的部分NS3和NS4区重组表达抗原（C100）作为固相包被进行检测；第二代试剂利用来自HCV基因组NS3区的C33C和部分NS4区的融合表达抗原（C200）、再加上C区的核心抗原C22-3作为固相包被进行检测；第三代试剂在第二代抗原的基础上，又加入了来自NS5区的重组表达抗原，另外，部分公司的产品中又引进了合成肽抗原。 初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂。第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板，以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用，特异性有了很大提高。第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体，进一步提高了敏感性。第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测，把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板，可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。 梅毒螺旋体感染的免疫测定 ㈠ 非特异性实验（类脂质抗原血清学实验） 梅毒螺旋体在破坏机体组织的过程中，体内释 放出一种心磷脂抗原，这种抗原可刺激机体产生相应的抗体即反应素，其与牛心中提取的心磷脂在体外可产生免疫结合反应。此类试验包括 VDRL ,USR(显微镜观察) RPR,TRUST(肉眼观察) RPR主要用于治疗效果的监测。 ㈡特异性试验 梅毒螺旋体抗体检测主要包括 荧光密螺旋体抗体吸收试验FTA-ABS、 梅毒螺旋体血凝试验TPHA、 梅毒螺旋体明胶凝集试验TPPA和ELISA。 临床中常用的有TPPA试验和ELISA法。 TPPA结果的判定方法 ? 反应图像判定粒子成纽扣状凝集，呈现出外周边缘均匀且光滑的圆形（-） 粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形（?） 粒子环明显变大，其外周边缘不均匀且杂乱地聚集在周围（+） 产生均一的凝集，凝集粒子在底部整体上呈膜状延展（++）? HIV和TP阳性结果的处理流程 TP阳性s/co大于0.23，只能报可疑阳性同时需加做TPPA实验。