大肠杆菌分子克隆载体详解.pptVIP

* *第三节大肠杆菌分子克隆载体 一、E.coli克隆载体的种类 1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段，以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。 二、质粒与质粒载体 1. E．coli的质粒种类1) colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。2) R因子（抗药性因子）可接合转移DNA，属低拷贝严紧型， 质粒较大，操作不便3) F因子（性因子） 2.质粒的特点1) 质粒DNA复制与染色体复制无关2) 质粒DNA以超螺旋形式存在3) 质粒DNA可以接合转移4) 质粒的不相容性和不相容群5) 质粒DNA的消除—化学和物理法(吖啶染料，EtBr，高温等)6) 质粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色体中 3.质粒DNA的转移1）质粒DNA的转移过程质粒的自主转移过程 质粒DNA的转移和复制2）质粒转移的必备条件ⅰ.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点—顺式 作用（cis-action）ii. 细胞附属物—性纤毛，由蛋白质构成—反式作用ⅲ.转移过程所需的全部酶类—反式作用3）质粒转移类型ⅰ.自我转移（Self-transmissible）ⅱ.辅助转移（Donation）—可转移质粒仅具备oriT，若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移。ⅲ.重组转移（conduction）—若质粒无oriT，该质粒只有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移。因此，用于克隆外源DNA的分子克隆载体，只要具备oriT即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒上，该质粒一般没有oriT，因而可以减少后者进入另一种细胞的频率。 质粒自主转移 质粒的辅助转移 质粒的重组转移 R-重组DNA分子4.质粒DNA的复制和调节控制1) 复制机制—复制方向、终止和方式2) 质粒拷贝数的控制—抑制剂模型：高拷贝质粒需高浓度抑制剂，低拷贝质粒需低浓度抑制剂，同一不相容群质粒产生的抑制剂可交叉相互作用。3)?质粒的复制调控机制 例子: ColE1质粒的复制及复制起点结构Boros etal.(1984)分离到一个pBR322突变体，其拷贝数可达1000/ cell或65%总DNA，原因是在RNAI基因的3端附近发生一次G→T颠换。 ColE1质粒 复制起点结构 质粒DNA的 复制过程 5.大肠杆菌质粒载体1) 常用质粒载体的复制子质粒载体复制子来源拷贝数pBR322系列pMB115-20pUC系列pMB1500-700pACYC系列p15A10-12pSC101系列pSC10125colE1colE115-202) 质粒载体常用的遗传标记基因Apr Cmr Kanr Neor Tcr Hygr LacZ LacZα3) 多克隆位点区大多数从pUC系列中的多克隆位点衍生出来的6.实例—pUC18和pUC19pUC系列质粒载体由Messing et al.构建，具有三个显著特点：1）分子量小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大2）易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα3）多克隆位点区ⅰ.多克隆位点成对地存在于pUC18和pUC19中，位点排列顺序相同，但方向相反。这种排列方式有利于外源DNA的克隆和定向插入ⅱ.产生不同末端规律排列: 两端限制酶位点产生5’—突起端（EcoRI和HindⅢ），与之相邻的两个限制酶位点产生3’—突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四个限制酶位点产生5’—突起端或平端。这种排列方式十分有利于插入DNA片段的单向缺失和缺失片段的回收。 pUC18和pUC19载体如插入片段的5’段定向缺失: XbaI→SphI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase; 插入片段的3’-端亦可采用类似的方法进行缺失（SmaI→SstI→ExoⅢ→S1→T4 DNA lingase）不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组。又例如: pBS+多克隆位点区的排列顺序是(见图)：假设有一EcoRI→HindⅢ DNA片段，并要求在其3’-末端或5’-端接上另外的DNA片段（如终止子、启动子），显然，pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用pBS+中的多克隆位点区就能满足要求。 ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的绘制。除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源基因 （LacZα启动子）。 pBS载体的结构 三.?噬菌体载体1. 噬菌体λ载体1）