Ras基因在EColiBL(DE)菌株中的表达.docVIP

Ras基因在E.Coli BL21(DE3)菌株中的表达 王 胜 (化工与制药学院04级生物技术1班 学号：15)指导老师： 秦 琴 职称： 讲 师 摘要：重写！ β-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannan mannanohydrolase,EC3.2.1.78）是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多醣（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡苷聚糖）的内切水解酶。它属于半纤维素酶类，可以把葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖、β-甘露聚糖等植物多糖降解为甘露寡糖。甘露寡糖在新药、饲料添加剂等方面的应用有极大的潜力-甘露聚糖酶能将魔芋精粉中的葡甘聚糖转化为水溶性的甘露低聚糖。利用基因工程技术，将甘露聚糖酶基因在大肠杆菌中克隆表达，是高效、快捷、经济获得此酶的途径之一。在本次实验中，笔者采用PCR方法从带有甘露聚糖酶基因的菌株中扩增出该基因片段，将其转入由大肠杆菌DH5a制备的感受态细胞中，通过蓝白斑筛选获得了阳性克隆子，然后将目的基因片段构建到大肠杆菌表达载体中并转入大肠杆菌表达系统，获得了甘露聚糖酶基因的表达 1.Ras (rat sarcoma,Ras)是。。。。。。。。。。。。Ras蛋白为膜结合型的GTP/GDP结合蛋白,相对分子质量为21kDa，定位于细胞膜内侧，意义。 2.本人作者通过摸索PCR反应条件和反应体系，技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的ras基因序列， 3，然后将ras基因克隆至带六个 融合表达载体pET28 中转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达重组融合蛋白，SDS分析表达产物. 实验结果表明，采用融合表达载体pET28高效表达出相对分子量约的重组融合蛋白. ras蛋白的表达为。。。。。。。。。。。。。。。。。为进一步研究ras的功能提供了理论基础 ras基因家庭包括同源的Ha-ras, Ki-ras和N-ras， kDa结构相近的P21?均编码分子量为21ras蛋白，人类正常细胞中的ras癌基因对细胞内的代谢、生长、分裂具有重要作用。ras基因的激活能启动和加速细胞的生长、增殖，以至造成细胞的恶性转化。 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是一种选择性体外核酸扩增技术，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成，每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断，可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 α-互补现象筛选转化子是最常用的一种鉴定方法。由于载体上带有大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列，这个编码区中插入了一个多克隆位点, 但并没有破坏lacZ的阅读框架, 不影响其正常功能。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal下存在下被IPTG诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落. Ras(P21)蛋白位于细胞膜内侧，它在传递细胞生长分化信号方面起重要作用。它属于三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白(一种细胞信息传递的耦联因子)，通过GTP与二磷酸鸟苷(GDP)的相互转化来调节信息的传递。研究 ras基因在临床中有很多应用，比如可用来进行疾病的诊断，病情评估及预后判断以及治疗等。 关键词：ras基因；聚合酶链反应；α-互补现象； Ras(P21)蛋白 方法: 采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF 的GCRG224 cDNA序列将其克隆至硫氧还蛋白融合表达 载体pET102/D-TOPO 中转化大肠杆菌BL21 经IPTG 诱导表达重组融合蛋白SDS分析表达产物. 结果: 高效表达出相对分子量约16 800的重组融合蛋白. 薄 层凝胶扫描显示其表达量占菌体总蛋白质的22.3%. 结论: 在大肠杆菌中成功表达了GCRG224重组融合蛋白.The expression of ras gene in E.Coli BL21(DE3) （School of Chemical Engineering and Phar