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实时定量PCRReal-Time Quantitative PCR 梁　沛 中国农业大学昆虫学系 主要内容 基本原理 几个概念 绝对定量 相对定量 常见问题 一、基本原理 发展简史 1993年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR技术的概念。 　　荧光染料：EB（溴乙锭） 　　PCR仪：改良的热循环仪 　　激发光：UV射线 　　检测器：CCD相机 　　缺点：仪器耗费巨大；非特异产物导致定量不准确 发展简史 1995年美国PE公司成功开发TaqMan技术 1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统 优点： 　　操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等 实时定量PCR的概念 实时定量PCR技术（real-time quantitative PCR） 　　是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过监测荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，并利用特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。 两种荧光标记法 染料染色 　　-SYBR Green I 　　-EB 探针标记 　　-Tagman 　　-Tagman MGB 　　-分子信标 化学原理 染料法的优缺点 优点： 实验设计简单，仅需要设计上下游一对引物，不需要设计探针，通用性好； 成本低； 可通过溶解曲线分析检验扩增产物的特异性。 在低通量实验和单重实验时一般优先考虑使用SYBR Green I染料法。 染料法的优缺点 缺点 SYBR Green I方法对PCR扩增特异性要求较高 　　　SYBR Green I 可与所有的双链 DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性 SYBR Green I 不能区分不同扩增子发出的荧光而导致它不能用于多重反应 Tagman Probe Tagman probe 的工作原理 探针与PCR产物的数量关系 每产生一个新的DNA片段，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位的荧光信号 信号强度与DNA的copy数成正比 探针法的优缺点 优点： Tagman探针法中，除引物外，还使用了一条特异的探针，因此此方法可以特异的检测目标序列，防止非特异产物的干扰影响定量的准确性 可用于多重反应，即可同时检测多个目的基因。 缺点： 但探针设计成本较高，有时探针设计困难。 二、几个概念 1.扩增曲线 描述PCR动态进程的曲线即扩增曲线。 PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线（图3） 1.扩增曲线 扩增曲线分三个阶段： 荧光背景信号阶段(基线期)：扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。 在平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。 荧光信号指数扩增阶段（对数期），PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可选择该阶段进行定量分析。 2.荧光阈值 一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。 是人为设定的一个值，可设在指数扩增阶段任意位置上。 缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（自动）。 2.荧光阈值 常采用手动设置，原则：大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是超过域值的荧光信号。 3.Ct值 Cycle threshold，所谓Ct值就是当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 Ct值的重现性 3.Ct值 Ct值与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，达到阈值所需的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。 正常的Ct值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。 Ct值定量的数学原理 Ct值定量的数学原理 Ct值定量的数学原理 Ct值定量的数学原理 靶标基因的定量 靶标基因的定量 靶标基因的定量 三、绝对定量 三、绝对定量 三、绝对定量 标准品的一些标准： 必需用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同 标准品必需是经过准确定量的（例如，用分光光度计定量） 标准品必需是标准化的（例如，同一化的细胞数） 在每组实验时，必需用相同的阈值设定来确定Ct值 三、绝对定量 标准品的制备： 1.化学合成目的基因，优点是纯度高、定量准确，缺点是受化学合成工艺限制，只能合成120bp以下的长度； 2.用回收纯化后的PCR产物 3.将PCR产物克隆到载体上，然后抽提出质粒，经过测量浓度和拷贝数的换算，可准确定量，优点是稳定、准确。 三、绝对