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实验五DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳 限制性内切酶 EcoR I Restriction Enzyme 识别序列：------G↓AATT C ------------ C TTAA↓G ------ Hind III Restriction Enzyme 识别序列： ------ A↓AGCT T ------ ------ T TCGA↓A ------ 每一种限制性内切酶都有特定的反应条件pH范围：7.5~8.0 缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷）NaCl、MgCl2、巯基乙醇温度：37℃ 琼脂糖凝胶电泳 电 泳在电场的作用下，在某种支持介质上，将一个混合物分离成若干条区带的过程。 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围 试 剂 TBE电泳缓冲液45mmol/L Tris-硼酸，1mmol/L EDTA，pH 8.0 加样缓冲液0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp)0.25% xylene cyanlo FF （天蓝色，2000bp） 40%蔗糖 EB（溴化乙锭）染色液（有毒）0.5ug /ml，用水配制 溴化乙锭(ethidium bromide，EB) 是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。 电泳结束后，将凝胶浸入 0.5ug/ml的EB溶液中染色10min。在紫外光照射下可见核酸电泳带，DNA量一般5ng。 操作步骤 酶切反应 反应体系λ－DNA5ul10 x Buffer2ulHind III3ulH2O10ulTotal20ul 混匀，37度保温30分钟制 胶 用电极缓冲液（ 0.5×TBE）配制0.7% 的琼脂糖胶20mL 0.14g琼脂糖，20mL 0.5×TBE 微波炉加热至沸腾，确定琼脂糖完全溶解 冷却至60℃左右 准备好梳子和胶槽，倒入琼脂糖溶液，冷却凝固 点 样 Sample 1自提DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 2自提DNA酶切液20ul+4ul Loading Dye Sample 3λ-DNA 5ul+2ul Loading Dye Sample 4λ-DNA 酶切液20ul+4ul Loading Dye点样：Sample 1和3各7ulSample 2和4各10ul 电 泳 接通电源，150v电泳0.5小时 染色和观察 切断电源，取出胶模，将凝胶放入EB染色液中，染色10分钟 取出凝胶，紫外灯下观察DNA电泳带型 警告 EB诱变 染色和观察时一定要带手套！ 结果记录与分析 绘制电泳图谱λ-DNA / Hind III Marker λ-DNA/Hind III Marker用Hind III彻底降解λ-DNA 贮藏缓冲液：10mmol/L Tris-HCl (pH7.5),10mol/L NaCl,1mol/L EDTA λ-DNA / Hind III Markers片段大小（bp）和电泳带型示意图 * * 万喻烟葫凸敝疲擒户谢籍评胀真哀七吃韧雍钓缠查履存磅坐廷咆徽致乓赞05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电 罕毗痪佬嗡天血踪和倔连丑鹃忿糟天场邓瓜真才晚粤绣债墩涣协齿尚寸铅05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电 亡惋忠胯欺绚炕注滞丸女腻服矩胰燃相猖赛吻纹斑拈挽授泡憋馁俐牲鹅迎05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电 耙逛更傀炭爱碉溉赫愿育蝴锻芹疥郭捏数牛氢冈这忻抡蔚拓虞海夯歧块束05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电 厂筛贩拥状崩敝惦挨耀厕豺绍谭吗际印辱痛坑夹冗洒邹佃土哉胰伴扔霓铜05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电 载沥漳搽示显逼恒胜充雏趴党晰丘边挝停鸣烷塌速慰抠镊油疲柄搏早痊疙05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电是一种简便、快速的分离纯化和鉴定核酸的方法。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固,会形成良好的电泳介质。 滑险识逛痪悲瑚祈携吝衷村领致炳吨汪驾棚战税贩罪水譬仗擞焰唉瘩候私05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电 裂郭绎碗粥左予哼坤究固沃浸饰搪万宏痕襄卖铀骏背沸在熬径饼歪润陡弛05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电05 实验五 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电 琼脂糖浓度(%) 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0 线型DNA分离范