二维电泳详细过程总结.doc

北京六一仪器厂DYCZ-26C双向电泳系统检测报告 技术部 吴承疆 QQ: 实验原理： 双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，已得到广泛应用。这项技术利用蛋白质的两种特性，分两步将不同的蛋白质分离。 第一向步骤为等电聚焦（IEF），即根据蛋白质的等电点（pI）差异将蛋白质分离。第二向步骤为十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），即利用蛋白质的分子量（Mr, 相对分子量）差异将蛋白质分离。双向凝胶电泳结果中的每个斑点都对应着样本中的一种蛋白。因此，可将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量等信息。 实验方法： 一.实验材料: 1.主要仪器和试剂（sigma,Ampholine购自GE） 主要试剂 超纯水（MiLiQ）、尿素、硫脲Thiourea)、Dithiothreitol，DTT、CHAPS、(Iodoacetamide，IAASodium Dodecylsulphate，SDS溴酚蓝Bromophenol Blue)、低熔点琼脂糖、过硫酸铵(Ammonium Persulfate APS)、TEMED（四甲基乙二胺）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺；Tris碱、甘氨酸、硝酸银、无水碳酸钠、无水乙酸钠、硫代硫酸钠、甲醛、无水乙醇、冰醋酸、氢氧化钠、磷酸、甘油（丙三醇 glycerin ）、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、蛋白质marker、蛋白定量试剂盒 主要仪器 DYCZ-26C、DYY-16D、DYY-6D、高速离心机紫外分光光度计超声波破碎仪Millipore纯水仪(法国Eppendorf普通离心机UMAX扫描仪台湾；摇床pH计 尿素8M4.805g CHAPS4%0.4g DTT65mM0.098g（现加）每小管5毫克 2%Ampholine （40%）0.5 ml（现加） 每小管25微升 溴酚蓝0.001% 10μl （1% 溴酚蓝） MilliQ水 定容至10ml ，分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存 样品覆盖液（含8 mol/L尿素，1% Ampholine） 取4.8g新鲜尿素（超纯），0.3 ml Ampholine，用去离子水定容至10mL，分装，每管含有100 uL，置于-20℃冰箱内保存。 胶条平衡缓冲液母液 尿素6M36g SDS2%2g Tris-HCl0.375M pH8.825ml（1.5M pH8.8 Tris-HCl） 甘油20%20ml MilliQ水 定容至100ml 分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。 胶条平衡缓冲液I 胶条平衡缓冲液母液10ml DTT0.2g 充分混匀，用时现配。 胶条平衡缓冲液II 胶条平衡缓冲液母液10ml 碘乙酰胺0.25g 充分混匀，用时现配。 低熔点琼脂糖封胶液 低熔点琼脂糖0.5%0.5g Tris25mM0.303g 甘氨酸192mM1.44g SDS0.1%1ml（10% SDS） 溴酚蓝0.001%100μl（1%溴酚蓝） MilliQ水 定容至100ml 加热溶解至澄清，室温保存。 第一向聚丙烯酰胺凝胶储液 丙烯酰胺7.09g 甲叉双丙烯酰胺0.405g MilliQ水 溶解后定容至25 ml 第二向30% 聚丙烯酰胺贮液 丙烯酰胺150g 甲叉双丙烯酰胺4g MilliQ水溶解后定容至500ml 滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。 1.5mol/L Tris碱 pH8.8 Tris碱90.75g MilliQ水400ml 用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4℃冰箱保存。 10% SDS SDS10g MilliQ水100ml 混匀后，室温保存。 10% Ap Ap0.1g MilliQ水1ml（用时加水溶解） 溶解后，4℃冰箱保存。 10×电泳缓冲液 （1×= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3） Tris碱30g 甘氨酸144g SDS10g MilliQ水1L 混匀后，室温保存。 第一向电极液母液（用前稀释10倍） 正极电极液母液（0.1 mol/L磷酸）：取6.75mL磷酸用去离子水定容至1000mL。 负极电极液母液（0.2 mol/L NaOH）：取16.48gNaOH，用去离子水定容至2000mL，置于4℃冰箱内可以保存2周。 注意：正负极缓冲液体系有多种，要分离不同PH范围的蛋白质，需要选择恰当的缓冲液体系。 3.实验操作 A.第一向IEF.凝胶柱的玻管准备准