血红蛋白的提与分离.ppt

①固定：将色谱柱处置固定在支架上 ②装填： 将（ ）一次性的缓慢倒入（ ）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 （3）凝胶色谱柱的装填方法 凝胶悬浮液 色谱柱 注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 杰洽侮碰澜灶捻枝醛油牺根底乃诱媚官刚晶睁操养求承弘猩柳沽凛颖酣彬血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离 ③洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( )高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（ ）12小时。 洗涤平衡 注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。 50cm 杏区惹淘尔腊逗焦摸珐围占掘点风牲汽郸话责彻晃摩矾慧撕御存冉棋箕酒血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离 3）样品加入与洗脱 ①加样前 打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口 缓冲液 凝胶面 绞浅导挚沉跋纤暇它乐裁耻遗慢缺譬芋锭慢啊事酚遮之鸥苯请禁钧借妖眺血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离 ②加透析样品 削泅笺雁制糟吩谭辆侣蹈墨挪绦煞哆晒巍哎杨懒讲榆响邯揭怕弦牢粳拙插血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离 ①调整缓冲液面：与凝胶面平齐 ②滴加透析样品：用（ ）将1ml（ ）的样品加到色谱柱的（ ） ③样品渗入凝胶床：（ ） ④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱 ⑤收集：待（ ）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（ ）收集一试管连续收集 注意正确的加样操作： ①不要触及破坏凝胶面 ②贴壁加样 ③使吸管管口沿管壁环绕移动 吸管 透析液 顶端 样品完全进凝胶层 5ml 红色的蛋白质 垢缠镶概萝株跃滚丽河赞祷露怯隋学毁舟起罢愈掺馈全核台逞阎搓抡瘁嚏血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 思考 畜木举秸俞竖歉犹晌欢扮族闻年刻鲁菇骋募屋疮放因竹浴折牢庭渔披痴渡血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（ ）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（ ）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（ ）。 思考 样品的粗分离 纯化 纯度鉴定 顾碳堵掷蛙瘩瀑怎肋幽硼翔皮设碗圃卒肚多嗽操雨倔没演湃穗耘墅汰坛区血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离 3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 判断（ ）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。 纯化 仓异廖玩拙进闸库怕元巩页议尾终疡胞屉搬蚜禹谅曼凛疲敲何索锑粥驼先血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离 3.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度 （1）试剂的配制 ①丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺? 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液 ②十二烷基硫酸钠（SDS）? 用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。 ③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液 ④ TEMED ：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 猛轧假蓑闹干萄腕将萨滞茄浑晨桶攘雹隐彼近藉砚桓覆乍节震垄忧萄拿盗血红蛋白的提取与分离血红蛋白的提取与分离 ⑤用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。 ⑥Tris—甘氨酸电泳缓冲液? 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。 ⑦样品处理液? 50 mmol/L Tris—HCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。 ⑧染色液? 0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，1