20121115细胞免疫检测技术导论.ppt

细胞免疫检测技术 欧长波 2012-11-16 课程内容 背景知识 免疫检测技术 实验内容 细胞免疫 Cell-mediated immunity is an immune response that does not involve antibodies but rather involves the activation of phagocytes, natural killer cells (NK), antigen-specific cytotoxic T-lymphocytes, and the release of various cytokines in response to an antigen. 细胞免疫（cellular immunity） T细胞受到抗原刺激后，增殖、分化、转化为致敏T细胞(也叫效应T细胞)，当相同抗原再次进入机体的细胞中时，致敏T细胞（效应T细胞）对抗原的直接杀伤作用及致敏T细胞所释放的细胞因子的协同杀伤作用，统称为细胞免疫。 检测对象 免疫细胞数量（E玫瑰花环形成实验，流式细胞术） T细胞亚群 （间接免疫荧光法，流式细胞术, 免疫磁珠） 细胞因子检测技术（ELISA，定量PCR, Elispot） 免疫细胞活性 (淋巴细胞转化实验) 应用范围 1、测定患病个体的细胞免疫状态与水平，以分析其发病机制； 2、测定动物疫苗免疫或抗原注射后机体的细胞免疫反应 3、筛选免疫增强剂或免疫抑制剂药物，或研究化学药物、营养成分以及物理疗法对机体免疫功能的影响 4、在研制细胞因子制剂过程中，测定其活性及效价 T细胞亚群 辅助/诱导T淋巴细胞（CD3+CD4+）、抑制/细胞毒T淋巴细胞（CD3+CD8+）、CD4+T细胞纯真亚群（CD4+CD45RA+/ CD4+CD45RA+62L+）和记忆亚群（CD4+CD45RA-/ CD4+CD45RO+）、功能亚群（CD28+）、激活亚群（CD38+、HLA-DR+）、凋亡亚群（CD95+） 1. E玫瑰花环形成试验 erythocyte rosette test 实验原理：人和动物外周血中T细胞表面有红细胞受体（即CD2分子），在体外能直接和异种或同种动物红细胞（SRBC）结合形成玫瑰花样细胞团，以此来区分T、B。 2.流式细胞术 定义：流式细胞术(Flow?Cytometry,?FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,?同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,?在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;?能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 一种细胞分选或分析技术。即以荧光素标记抗体结合相应细胞，用激光束激发单行流动的细胞，根据细胞所携带荧光(强度或类别)进行分选或分析。 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷 酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流式细胞术--- T细胞亚群 具有CD3抗原的T细胞：外周血成熟的T细胞 具有CD4抗原的T细胞：TH（机体免疫应答的启动细胞，促进T细胞、B细胞免疫应答，活化的TH细胞可释放IL-2及IFN-r） 具有CD8抗原的T细胞：Tc（在TH辅助下特异性杀伤或溶解靶细胞） 3. 间接免疫荧光法检测淋巴细胞CD抗原 免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。 4. 免疫磁珠分离法 * 免疫磁珠分离法：将针对细胞某种表面标记的特异性抗体包被在磁性微珠上，与磁珠交联的抗体能够特异性结合具有这种表面标记的细胞，然后用强磁场可将具有这种表面标记的细胞分离出来。 磁珠分离策略： 5. 固相酶联免疫斑点技术 ELISPOT 　细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后， 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果. 与ELISA的区别 1、ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出定量的可溶性蛋白总量。 　2、ELISPOT