实验 维素酶活力的测定.docVIP

实验 纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法） 一、实验目的 掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力的方法。? 二、实验原理 纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，故可利用比色法测定其还原物生成量来表示纤维素酶的活力。 三、主要仪器与试剂 (一)实验仪器 1. 25mL比色管 2. 722型分光光度计 3. 滴管 4.水浴锅 5.移液枪 6.电炉 (二)、试剂 1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10.0 g 3,5-二硝基水杨酸，溶入200mL蒸馏水中，加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水至500mL，升温溶解后，加入重蒸苯酚2.0g，无水亚硫酸钠0.50g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000mL。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2. 0.1mol/L pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。 3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。? 4. 葡萄糖标准溶液：称取干燥至恒重的无水葡萄糖100mg，溶解后定容至100mL， 此溶液含葡萄糖1.00mg/mL。 5. 纤维素酶液：将0.05g酶溶解定容至50 mL，从中取出1.0mL再定容至100mL，待检测用。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制） 四、实验步骤 1.标准曲线的绘制：分别吸取0.0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00m L 葡萄糖标准液于6支25mL比色管中，均用蒸馏水稀释至1mL，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL，在沸水浴中煮沸显色10min，冷却，加蒸馏水21mL，摇匀。以空白管调零，在550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖μg数为横坐标，绘出标准曲线。 序号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标液 0.0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水 1.0 0.80 0.60 0.40 0.20 0.0 3,5-二硝基水杨酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 实验操作 沸水浴加热10min，冷却后，加水定容，摇匀，比色测定 吸光度A550nm 0.0 2.空白管的测定： 在2支25mL试管中各加入1.0mL酶液，沸水浴5min，冷却后加3.0mL 0.5%CMC-Na，与样品管同时放入50℃水浴30min。其它操作同样品管。 3.样品的测定：在3支25mL试管中各加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液3.0mL，酶液1.0mL，于50℃水浴中糖化30min，取出，立即于沸水浴中煮沸10min使酶失活，得糖化液，冷却加入3.0 mL 3,5-二硝基水杨酸显色液，再沸水浴10min，冷却后加水定容至25mL，混匀，以空白管调零，在550nm处测OD值，查葡萄糖标准曲线得样品的葡萄糖μg数。? 五、结果计算 在上述条件下，1㎎酶每分钟催化纤维素水解生成1微克葡萄糖定为一个活力单位。 纤维素酶活力单位（μg / mg·min）＝ 式中：N—酶液的稀释倍数，此处为100 30—糖化所用时间，min 1—反应酶液的mL数 六、注意事项 1.无论是标准液还是样品液，都要去除葡萄糖外的其他各种成分的对OD值的影响。使得到的标准曲线经过坐标原点。 2.用移液管或移液枪加各试剂时，不能将移液管或移液枪头混用。各比色管中，均用蒸馏水稀释至1mL，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL，在沸水浴中煮沸显色10min，冷却，加蒸馏水21mL，摇匀。 Determination of Cellulase Activity 1. Purpose of Experiment Master the principle of determination of reducing sugar,Learn the method of determinating cellulase activity using 3,5-dinitro salicylic acid method. 2. Experimental Principle Cellulase can hydrolyze cellulose to produce reducing sugar such as cellobiose and glucose. Those sugars can reduce nitro of 3,5- dinitro salicylic acid into amino to form orange yellow amino compounds, so colorimetric method can be used to determine t