9.28.2015-Western_Blot_孟丹.ppt

将制好的三明治放入电转槽中，注意正负极的方向，凝胶侧为负极，转印膜侧为正极。 转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白，将膜晾干备用。 将凝胶用考马斯亮蓝染色，观察凝胶中的蛋白是否完全转至印迹膜上。 转移膜的选择 最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 - 滤纸 凝胶 膜 滤纸 + 湿转系统 注意事项： 1.胶在负极，膜靠近正极 2.保证每层之间没有气泡 3.转膜过程产生大量热量，需冰浴 夹板 海绵 滤纸 凝胶 膜 滤纸 海绵 正极 负极 半干转印系统 注意： 防止短路！ 转膜后检测 丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。 封闭 作用：为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 封闭剂： 5%脱脂奶粉或BSA，或3%明胶溶于TBST Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） 室温孵育1h或4℃过夜 注：Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。 一抗、二抗孵育 1.把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 2.用TBST漂洗膜3-5次，每次5-10min。 3.加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 4.用TBST漂洗膜3次，每次5-10min。 5.最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 6.加入显色底物进行显色反应。 加入一抗，室温孵育1-2小时或4℃过夜 洗膜 加入二抗，室温孵育1-2小时或4℃过夜 洗膜 显色 不同标记的二抗及成像方法 125I标记的抗体 X-光片压片显色 荧光基团标记的抗体 凝胶成像仪不同标记的二抗及成像方法 酶标抗体 ：如HRP（辣根过氧化物酶）、AP（碱性磷酸酶）等 成像方法：加酶的底物产生显色反应或化学发光反应显色反应：TMB，CN，DAB等显色底物优点：方便、便宜，直接成像缺点：有毒、灵敏度较低、背景高、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光显色：标HRP二抗加ECL底物发光反应压片或CCD成像优点：灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测灵敏度：二者接近！CCD≥胶片曝光压片 vs. CCD成像 压片 CCD成像 价格 便宜，但需要不断投入 比较贵，但只需一次投入 需要暗室 是 否 有毒？ 有毒，污染环境 无毒，环保 操作 复杂 简便快速，且可连续曝光不同时间 成像质量 压片后需要二次成像，图像有一定损失 一次拍照，永久保存 是否能直接叠加Marker 否，需要比对划线 是，快速直接叠加 动态范围 比较小 宽，可达到4.6个数量级 是否可以定量分析 否 是，仪器自带分析软件 压片实例 压片：无法准确获得目的条带的大小，只能固定胶片位置在胶片上标出Marker的大概位置 CCD成像 动态范围大，能直接叠加Marker，便于后期图像的处理及分析 Marker直接叠加在化学发光图像上Western Blot化学发光成像 其他成像方法示例 Western Blot结果分析 目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 分析软件如Image J等 Western Blot常见问题分析 SDS电泳 胶不平？ 凝胶漏液？ 胶玻璃板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐 条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？ 条带微弱？ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 蛋白浓度不够，加大上样量 蛋白样品是否保存良好，不能反复冻融，提取过程防止蛋白降解 SDS电泳 转膜及抗体检测 凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不