10生工基工程课程实验指导.docVIP

基因工程综合实验 2013.5 本综合实验包含的实验内容：质粒DNA的提取、DNA的凝胶电泳、质粒DNA中靶基因的酶切分析及质粒DNA中重组进的靶DNA序列的PCR扩增，通过本综合实验，帮助大家理解质粒DNA的提取原理、凝胶电泳中DNA分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR是如何实现DNA扩增的，通过实验同时让同学掌握DNA的提取技术、凝胶电泳技术、DNA酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。 以下为按照内容划分的实验指导： 实验一、碱裂解法提取质粒DNA、质粒DNA的纯化和凝胶电泳分析 一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。 二、实验原理 在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。 三、实验材料 大肠杆菌DH5α（含重组了约1500bp DNA片断的pMD18-T表达质粒，Amp抗性） 四、实验仪器、用具 高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪 五、实验试剂 LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖 抽提质粒DNA所需的溶液： 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)； 溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)，现配现用； 溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2； 电泳缓冲液（0.5×TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0； 六、实验步骤： 1、质粒DNA的提取 在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已灭菌），37℃振摇培养过夜 (注：此步已经完成) ； 取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清；（注：先倒液体入废液缸，再倒扣用吸水纸吸干液体，残留液体可移液器吸干） 加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡以充分混匀； 加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌； 加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min（常温也可，但产量可能下降）； 12000rpm离心5min； 吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL氯仿/异戊醇（V：V=24：1）充分混匀，12000rpm离心5min； 小心移取上清液500μL至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min，12000 rpm离心10min，弃上清；（静置期间安排制备琼脂糖凝胶，每组制胶一块，具体见附件） 加入200μL 70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干； 加入20μL RTE （含10μg/mL RNaseA 的TE，pH8.0）μL质粒DNA溶液于另一干净离心管中，加入8μL TE及2μL上样缓冲液，混匀后全部点样于一个琼脂糖凝胶点样孔中。 打开电源开关，调电压为80~100伏进行电泳 (注意电泳方向！！！)。 电泳约40分钟后关掉电源，把凝胶置于紫外仪上观察结果并记录。 七、结果与分析 根据实验得出的结果，分析影响实验结果的有关因素和实验过程中需要注意的有关事项。 附：1％琼脂糖凝胶的制作 以制30mL量的琼脂糖凝胶为例，具体过程如下： 1、称量0.3g的琼脂糖粉置于一干净的小三角瓶中； 2、加入30mL 0.5×TBE于三角瓶中，称出总重量并记录； 3、在微波炉中充分溶解（约1分钟），称溶解后的总重量并用蒸馏水补充至原总重量（注意不要烫到手！！）； 4、室温条件下放置或自来水冲三角瓶下部到溶液温度冷却到约50度（即以手敢捏三角瓶为准，注意过程中要经常摇动防止降温不均匀导致局部凝固现象），此时再加入1.5μL goldview染料(原则上按照100mL琼脂糖液加goldview染料3-5μL)，混匀； 5、把混