3第三章基因工程的载体和受体技术分析.pptVIP

pUC18、19的MCS方向相反 * 乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合， 使其构象改变离开lacO，从而激活转录.这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表 达系统载体构建的常用元件。 如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松弛型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)。 * cos序列是λ噬菌体 DNA 中将 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。 由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变。其中密码子改变为UAG的无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变。 * mp载体的关键：lacZ标记 * lacI：编码乳糖操纵子的阻遏蛋白 乳糖操纵子：大肠杆菌中控制β半乳糖苷酶诱导合成的操纵子。包括调控元件P(启动子)和O(操纵基因)，以及结构基因lacZ(编码半乳糖苷酶)、lacY(编码通透酶)和lacA(编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶)。在没有诱导物时，调节基因lacI 编码阻遏蛋白，与操纵基因O 结合后抑制结构基因转录；乳糖的存在可与lac阻遏蛋白结合诱导结构基因转录，以代谢乳糖。 * URA3:乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶 TRP1:色氨酸合成基因 * 不过，由于rec-菌株的生理条件较难控制，以rec-菌株作为受体菌时转化或转导效率往往比rec+受体菌细胞低得多，所以有时人们先以rec+受体菌起始转化，筛选到正确的转化子后，再转移至rec-受体菌中保存。 * （2）重要的噬菌粒载体 pUC118：pUC18 + M13间隔区 IG pUC119：pUC19 + M13间隔区 IG 500 个拷贝 3200 bp MCS lacZ’ lacI ori Ampr M13-IG pUC118 / 119 表示M13辅助噬菌体：为噬菌粒提供基因II产物和包装蛋白，使其能够合成单链DNA。 ①pUC118 / 119 第三章基因工程的载体和受体（5学时） * ②pBluescript：体外转录载体 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 2958 bp MCS lacZ’ PT7 ori Ampr f1-ori pBluescript PT3 噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录。 提取出来的单链DNA重组分子，在噬菌体RNA聚合酶的存在下，可实现外源基因的体外转录。 f1-ori：线状噬菌体复制起始区 第三章基因工程的载体和受体（5学时） * （四）人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人造染色体（BAC） 酵母人造染色体（YAC） 第三章基因工程的载体和受体（5学时） * 1.细菌人造染色体 Bacterial Artificial Chromosome，BAC 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子—F质粒的基础上构建的。 装载量：50 kb - 300 kb 拷贝数：各种类型的BAC在大肠杆菌受体菌中只能维持单一拷贝。 BAC主要适用于： ①克隆大型基因簇（gene cluster） ②构建动植物基因文库（gene library） 第三章基因工程的载体和受体（5学时） * 2.酵母人造染色体 Yeast Artificial Chromosome (YAC) （1）酵母人造染色体的组成 pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Ampr TRP1 ARS1 两个来自嗜热四膜虫的末端重复序列(TEL)：保持重组YAC为线状结构 酵母染色体的着丝粒序列 (centromere4,CEN4) 酵母选择标记：URA3、TRP1 大肠杆菌的复制子：ori 大肠杆菌的选择标记：Ampr YAC载体的装载量为350 kb-400 kb 酵母染色体的复制子 (autonomously replicating?sequence，ARS?) 第三章基因工程的载体和受体（5学时） * 克隆位点：EcoRI。该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。Sup4 基因编码产物抑制赭色表型 (成为白色)。如果用不含外源DNA片段的pYAC4载