第02章 谱分析技术hu.ppt

光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。 光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。 光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。 λ＝C/ν λ——波长 C——光速 ν——频率，单位时间通过一个定点的波数。 紫外可见吸收光谱的形成 按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系： E＝E2- E1＝h E1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级差小，△E＜0.05电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大， E＝0.05～1.0 ev，振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大， E＝1～20 ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区。 可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发态，电子由一个低能级的轨道（即成键轨道），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为反键轨道）。 若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波长λ作横坐标，“A”或“T”为纵座标，画出连续的“A~λ”或“T~λ”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。 ⑴曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以λmax表示。 ⑵曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以λmin 表示。 ⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰。 ⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。 λmax是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，λmax、λmin、-肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。 测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。 常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到七十年代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。 由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。 常用的术语 紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色效应。 发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n→π*、π→π*、 n→σ* 等电子跃迁的基团称为发色团。例如：C＝C、C＝O等发色团。 助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2、SH等）。这些基团在波长＞200 nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移（或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团相连接，产生 n→π* 跃迁，使吸收波长向短波移动，称为兰移（或深色效应）。 增色效应（hyperchromic effect）:核酸变性或降解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加，即 ε值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在260nm处测量。 减色效应（hypochromic effect）:在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时ε值又明显减少，回复到原来的核酸分子ε值较低的水平，即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。 3.3.3 利用生成惰性配合物 例如钢铁中微量钴的测定 常用钴试剂为显色剂，但钴试剂不仅与Co2+发生反应，而且与Ni2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、等都有反应。 钴试剂与Co2+在弱酸性介质中一旦完成反应后，即使再用强酸酸化溶液，该配合物也不会分解。 Ni2+、Zn2