第09章 酶免疫试验.ppt

三、ELISA的方法类型及反应原理 （三）竞争法测抗原 三、 ELISA的方法类型及反应原理 竞争法测抗体 三、 ELISA的方法类型及反应原理 竞争法（加中和抗原）检测抗体 三、 ELISA的方法类型及反应原理 竞争法（间接包被抗原）检测抗体 三、 ELISA的方法类型及反应原理 （四）捕获法 第四节 酶联免疫斑点试验 酶联免疫斑点试验 ELISPOT是从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞的检测技术 结合了细胞培养技术和ELISA技术。 主要用于细胞因子分泌细胞的定量测定。 一、基本原理 即用抗体捕获培养细胞所分泌的细胞因子，并以酶联免疫斑点显色方式将其表现出来。 二、数据处理及结果报告 ELISPOT检测的最终数据是细胞频率，即在细胞群体中，受某种特异性抗原刺激而分泌某种细胞因子的阳性细胞比例。 斑点形成细胞（SFC）数目可在显微镜下或采用酶联斑点分析仪自动化进行。 第五节 发光酶免疫试验 LEIA LEIA反应原理与ELISA相似，主要不同在于LEIA中酶作用的底物为发光底物。 常用标记酶为HRP和ALP 根据酶促发光底物的不同，可分为化学发光酶免疫试验（CLEIA）和荧光酶免疫试验（FEIA）。 一、基本原理 用参与催化某一发光反应的酶来标记抗体（或抗原）。 在抗原抗体反应后加入发光底物。 酶催化和分解底物发光。 由光检测仪检测发光强度，最后通过标准曲线计算出被测物的含量。。 二、化学发光酶免疫试验 HRP标记的酶促发光反应 通常采用的反应体系是鲁米诺/H2O2/HRP/增强系统。 二、化学发光酶免疫试验 ALP标记的酶促发光反应 三、荧光酶免疫试验 最常用标记酶是ALP。 最常用底物是4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP）。 第六节 酶免疫试验的临床应用及常用商品试剂的方法特点 重点提示 均相酶免疫试验 异相酶免疫试验：酶联免疫吸附试验 酶联免疫斑点试验 发光酶免疫试验 一、均相酶免疫试验 临床应用：可用于吗啡、地高辛等小分子物质的检测。 方法特点：试验无需分离和洗涤程序，整个过程都在均匀的液相中进行，具有简便、快速、利于自动化等优点。但应用非常局限。 二、异相酶免疫试验 （一）酶联免疫吸附试验 临床应用：用于血液及其他体液标志物的定性测定。 方法特点：基本上以聚苯乙烯塑料为固相载体，HRP作为标记酶，显色底物多采用TMB进行显色测定。ELISA操作简单，不需要特殊设备，ELISA结果易观察。 （二）酶联免疫斑点试验 临床应用：在监测HIV等疫苗研究免疫应答反应、移植研究、Th0/Th1/Th2细胞转换分析、自身免疫研究、过敏机制探讨及一些传染疾病研究。 方法特点： 灵敏度高。 检测的是单个细胞分泌。 ELISPOT操作简便经济，可以进行高通量筛选。 分析后不破坏淋巴细胞的活性，结果可以重复。 （三）发光酶免疫试验 临床应用：用于标本中微量物质的自动化定量检测。 方法特点： 灵敏度高。 线性范围宽。 系统测试速度快。 检测系统直接发光。 第七节 影响酶免疫试验的主要因素 主要影响因素 试剂盒原材料因素 标本因素 实验室环境因素 操作因素 本章小结 掌握： 固相载体种类、包被抗原或抗体方法、酶结合物及底物 ELISA的基本原理 ELISA常用方法类型及反应原理 ELISPOT基本原理及数据处理和结果报告 发光酶免疫基本原理及反应类型 * 第一章 血液标本采集与处理 临床免疫学检验技术 第九章 酶免疫试验 王宏志 目 录 第一节 酶免疫试验的组成要素 第二节 酶免疫试验的分类 第三节 酶联免疫吸附试验 第四节 酶联免疫斑点试验 第五节 发光酶免疫试验 第六节 EIA临床应用及常用商品试剂的方法特点 第七节 影响酶免疫试验的主要因素 第一节 酶免疫试验的组成要素 重点提示 固相载体 包被抗原或抗体 酶结合物 酶的显色底物与酶促发光底物 一、固相载体 微孔板：一般均使用聚苯乙烯塑料。 磁微粒：结合容量大，分离步骤简单迅速。 膜载体：包括NC膜、PVDF膜等，吸附能力较强。 ELISA板 二、包被抗原或抗体 直接包被：直接吸附于固相载体表面 ELISA：用碳酸盐溶液稀释包被抗体或抗原，加到微孔板中4℃过夜或者37℃ 2小时，常用牛血清白蛋白或小牛血清进行封闭。 ELISPOT：用磷酸盐缓冲液稀释包被抗体，加到底部覆以PVDF膜等的微孔板中4℃过夜，常用脱脂乳封闭。 包被抗原或抗体 间接包被：间接吸附于固相载体表面 亲合素-生物素化抗体（抗原）模式 葡萄球菌蛋白A（SPA）-抗体模式 三、酶结合物 既参与高度特异的免疫反应，又起到生物催化放大作用。 酶免疫试验测定的结果就是通过酶与显色底物或发光底物的相互作用来最终指