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2012-12-06 原 位 杂 交 技 术 一、原位杂交技术的历史发展原位杂交技术In situ hybridization，ISH是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时 Buongiorno—Nardelli和Amaldi等1970相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。 二、原位杂交技术的原理及分类 概念： 原位杂交技术In situ hybridization，ISH是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸即探针与组织、细胞或染色体上待测DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。 分类 1、 基因组原位杂交技术 　　基因组原位杂交GISH技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。 2、荧光原位杂交技术 　　荧光原位杂交FISH技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切片上的特异fl-N：~行杂交，通过荧光检测系统荧光显微镜检测信号DNA序列在染色体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。3 、多彩色荧光原位杂交技术 　　多彩色荧光原位杂交mFISH是在荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新技术，它用几种不同颜色的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交，能同时检测多个靶位，各靶位在荧光显微镜下和照片上的颜色不同，呈现多种色彩。 4、原位PCR 　　原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。 三、原位杂交技术的一般过程 以经过标记的已知核酸分子为探针 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交 再对其探测 一）、探针 是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上 优点：⑴ 杂交效率比DNA探针高⑵ 在检测mRNA时所形成的RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定⑶ 可以同时得到同义RNA链和反义RNA链缺点：这类探针是根据靶分子而设计序列在DNA合成仪上用化学方法合成优点：形成杂交体快速（序列短链，杂交时易于穿透）缺点：特异性较低（短链和简单） 二）、探针标记 1、标记物 放射性标记物：同位素 35S、33P、32P 和 3H等 非放射性标记物：荧光素 生物素 地高辛溴脱氧尿嘧啶等 标记分子：某种单核苷酸在单核苷酸分子中导入某个原子、功能基团或侧链分子作为标记物，对碱基配对不造成影响 标记分子： 放射性标记分子：35S-UTP35S-dATP35S-dCTP32P-UTP 32P-dATP等等 非放射性标记分子：四甲基罗达明-UTP生物素-UTP Bio-UTP地高辛-dUTP Dig-dUTP溴脱氧尿嘧啶本身为标记分子 2、标记方法 （1）DNA探针标记切口移位法 随机引物法 （2）RNA探针标记在体外转录技术中与探针制备同时完成 （3）寡核苷酸探针标记末端转移法 三）、靶核酸分子 靶分子（或靶序列）：指所要探测的核酸分子或核苷酸序列（DNA 或RNA）DNA —— 可以是中期染色体上的或是间期细胞核内的，也可以是线粒体DNA或病毒DNA RNA —— 可以是编码细胞合成的任何蛋白质分子的mRNA，也可以是核糖体rRNA线粒体或病毒RNA四）、杂交1.杂交体2.杂交条件3.严格度的概念 1、杂交体 hybridsDNA-DNADNA-RNARNA-RNA 稳定性依次是：DNA-DNA ＜ DNA-RNA＜RNA-RNA 2、杂交条件 （1）杂交液 （2）探针浓度（3）温度（4）pH （5）时间 （