《麻纺韧皮纤维脱胶用碱性果胶酶的制备及表征》.doc

麻纺韧皮纤维脱胶用碱性果胶酶的制备及表征 Preparation and Characterization of Pectate Lyase for Bast-fibre Degumming 摘要：麻类纤维作为一种高档的天然纤维素纤维，有其他纤维难以比拟的优势：质地轻、强力大、防虫防霉、静电少、吸湿散湿、透气舒适、具有完全的生物降解性。在众多的纺织纤维中，麻类纤维是极具发展潜力的绿色环保纤维。然而，作为麻类纤维原料的原麻中含有大量的胶质，如果胶、半纤维素、木质素和蜡脂质等，不能直接用于纺纱工艺，必须经脱胶处理才能进行后续加工。目前，常用化学方法进行脱胶，但化学脱胶工艺过程不仅消耗大量的化工原料和能源，增加生产成本，造成严重的环境污染，而且化学试剂还损伤纤维结构，使麻类纤维更加粗糙，可纺性降低。生物技术的发展为改变落后的脱胶工艺提供了契机。以生物酶为基础的生物脱胶方法能够克服化学脱胶的诸多缺点，工艺过程快速高效、低能耗、无污染，更为重要的是，具有底物专一性的生物酶能够最大程度地保留麻类纤维的原有品质。 本课题一方面分离纯化了实验室筛选的Bacillus subtilis A5发酵液中的碱性果胶酶；另一方面利用分子生物学方法，获得了Bacillus subtilis A5在麻类脱胶过程中发挥重要作用的碱性果胶酶基因(pel)，进一步构建基因工程菌以表达可高度纯化的重组碱性果胶酶。最后对所获得的两种酶进行酶学性质及脱胶效果的比较研究。主要研究内容结果如下： 1、从中国湖南腐烂苎麻上筛选得到的Bacillus subtilis A5是一种能产生具有脱胶活性的碱性果胶酶的微生物。其发酵液经硫酸铵盐析分级沉淀、透析、离子交换层析、交联葡聚糖凝胶层析纯化，得到分子量约为45kD的碱性果胶酶。比酶活为5284.43 U/mg，整个纯化过程酶活回收率为4.24%，纯化倍数为6.05倍。酶最适反应温度为50℃，最适pH为9.6，较能够耐受高温和碱性环境。Ca2+对其有一定的激活作用。Co2+，Ba2+和EDTA对其有强的抑制作用。 2、根据GenBank上Bacillus subtilis 编码碱性果胶酶（pectate lyase）的基因(pel)序列，设计合成一对引物，以Bacillus subtilis A5基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增得到1260bp的DNA片段。序列测定表明，Bacillus subtilis A5的pel基因序列与GenBank: X74880.1序列相比存在9处碱基差异，同源性为99.3%。经过氨基酸密码子翻译后，除去氨基酸密码子同义突变处，共有2处突变，氨基酸序列同源性为99.5% 。Bacillus subtilis A5的pel氨基酸序列与文献中所报道的pel活性位点（钙离子结合位点）以及邻近钙离子的保守氨基酸均为一致。将PCR扩增获得的pel片段通过T载体连接，构建克隆质粒pMD-pel，转化大肠杆菌DH5α，获得重组转化子。双酶切克隆质粒pMD-pel，得到具有SalI和NotI酶切位点的粘性末端片段pel。通过定向克隆技术，将表达载体pET-28a-c(+)和粘性末端片段pel进行T4连接反应，构建表达质粒pET-pel，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，筛选后获得表达宿主菌株。 3、利用含表达质粒pET-pel的大肠杆菌BL21 (DE3)宿主进行诱导表达，产物经Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和纯化及稀释复性，得到分子量约为49kDa的重组果胶酶。比酶活为873.45 U/mg，获得的酶总量较大（3.6L发酵液中至少含4.4mg酶蛋白），纯度很高。酶最适温度为55℃，最适pH为9.6。与Bacillus subtilis A5所产酶相比，重组果胶酶的耐高温程度及耐碱性均有所提高。Ca2+同样对其有激活作用，Ba2+对其有强的抑制作用 。 4、利用实验制备的两种酶在最适条件进行脱胶效果测定，通过立体显微镜、光学显微镜观察，酶处理后的苎麻表面胶质基本去除，纤维分散程度好。Bacillus subtilis A5产果胶酶和重组果胶酶脱胶效果相差不大。由扫描电子显微镜观察，未经酶处理的原麻表面凹凸不平，有大量片状胶质，经过酶处理后的纤维成分散状，脱胶效果较好，纤维表面仅存在少许颗粒残余，Bacillus subtilis A5产果胶酶与重组果胶酶相比脱胶效果较好，表面更光滑。 本课题从野生菌发酵产物的分离纯化和基因工程菌的构建表达两方面对碱性果胶酶进行制备，并研究了所获得的两种酶的酶学性质及脱胶效果的比较。奠定了进一步研发高效脱胶酶制剂的基础，为麻纺纤维原料的绿色加工提供理论和技术支撑。 关键词：碱性果胶酶，生物脱胶，分离纯化，克隆表达，酶学性质。 Key wo