Western-blot实验方法步骤分析.pptVIP

免疫沉淀法检测表达蛋白 可用于检测并定量分析多种蛋白质复合物中的靶抗原。 很敏感，可检测出100pg的放射性标记蛋白。 当与SDS并用时，即可用于分析外源基因在原核和真核宿主细胞中的表达情况。 操作步骤 靶蛋白的放射性标记 裂解细胞 特异性免疫复合物的形成 免疫复合物的收集和纯化 放射性标记蛋白质的免疫沉淀分析 靶蛋白的放射性标记 同位素通常是35S，其半衰期为87.1天，同位素是以35S－标记蛋氨酸或35S－蛋氨酸和半胱氨酸。 这些氨基酸是哺乳动物细胞的必须氨基酸，必须由培养基中提供。 培养基中含有高浓度的蛋氨酸和半胱氨酸，为了增加同位素标记氨基酸的渗入率，可去除培养基中的蛋氨酸或同时去除蛋氨酸和半胱氨酸。 同位素标记的强度取决于被检蛋白的合成速度和其氨基酸的组成，以及该蛋白质的代谢速度。 免疫复合物的收集和纯化 用耦联葡萄球菌蛋白A和Sepharose进行吸附：结果清晰，但成本高，并且所需抗体有种系特异性的限制。 用经热致死并经甲醛固定的S.aureus细胞进行吸附：背景高，但是经济。 用抗被检蛋白抗体的抗体进行吸附，这种方法用于下列两种情况：1第一抗体的FC不能被葡萄球菌蛋白质A识别；2对被检蛋白进行定量分析时。 Western-blot 试验 概论 它结合了凝胶分辨力高和固相免疫测定的特异敏感等多种优点，与免疫沉淀法比较，这种方法无需对靶蛋白进行同位素标记。几乎总在变性条