微生物的纯培养分离纯化与平板计数.docx

微生物的纯培养、分离纯化与平板计数 实验目的了解微生物纯培养的目的与方法。掌握分离纯化微生物的几种方法。掌握通过用涂布平板法对微生物进行计数的方法。实验原理微生物纯培养的原理自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。使用显微操作器单细胞挑取法可以直接得到纯培养。通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果，纯培养物通常是通过人工培养方法获得的。获得纯培养物的关键有两点：（1）所有相关物品必须是无菌的。（2）分离单个微生物细胞并将其培养成一个群体。分离纯化微生物的几种方法从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。混合样品的分离方法包括两大步骤，使菌体浓度得到稀释使微生物的细胞或孢子以单独的状态存在，在适宜条件下形成菌落。如果将其接种到适当的培养基上就得到了纯种的微生物。分离纯化微生物的方法包含两类：一是达到菌落水平，另一类是达到细胞水平。菌落分离纯化方法包括：平板划线法，平板涂布法和倾注分离法。细胞分离纯化方法包括：单孢分离法和菌丝顶端切割法。平板划线法，平板涂布法和倾注分离法因方法简便、设备简单分离效果良好而被广泛使用。平板划线法原理：当通过划线法分离微生物时，培养物在固体培养基上通过划线被稀释。划线的目的是使细菌细胞间的空间足够大，这样单个细胞繁殖所产生的大量后代就会形成一个菌落。由此可见，菌落就是在固体培养基表面由单个微生物繁殖形成的肉眼可见的细胞集团，菌落也可以是由一群同类微生物繁殖形成。挑取但菌落进行扩大培养就是纯培养。（2）平板涂布法原理：将经过适当稀释的一定体积的菌液加到已凝固的平板培养基表面，然后用无菌涂布器速将其涂布均匀，如果涂布适宜，经培养后，在平板表面可以得到但菌落，从而达到离纯化微生物的目的。平板涂布法还可以用于微生物平板菌落计数。（3）倾注接种法原理：将待分离培养的菌液经过适当的稀释后，取合适稀释度的少量菌液加到无菌平皿中，然后加入融化并冷却至50℃左右的培养基，充分混匀，待凝固，在适宜温度下培养一段间，如果稀释得当，经培养后，可以从平板表面或内部长出单落，从而达到离纯化微生物的目的。倾注接种法也常用于微生物平板菌落计数，如水或牛奶的活菌数测定。在平板涂布法和倾注接种法中，平板涂布法比较适合于好氧细菌和有气生菌丝的放线菌的分离，而倾注接种法较适合兼性厌氧的细菌和酵母菌的分离。平板计数原理：稀释平板计数法是一种最常用的活菌计数法。其依据是微生物在高度稀释的条件下，在固体培养基上形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖形成的，因此一个菌落形成单位代表一个细胞。在计数的时候，首先将待测样品进行系列稀释，使待测样品中的微生物细胞成单个细胞存在，再取一定量的稀释液接种到固体培养基中（平板接种培养有两种方法：平板涂布法和倾注接种法，我们使用的是平板涂布法），使其均匀地分布于培养基的表面或内部（倾注接种法），经适宜培养后，单个细胞生长繁殖形成菌落，计数菌落数目，即可换算出样品中的含菌数目。平板菌落技术法常用语生物制品的检验、土壤含菌量的测定以及食品、水源的污染程度的检验等。实验材料1.菌种：大肠杆菌菌液。2.培养基：LB固体培养基。3.仪器：无菌涂布器、无菌吸管6支、接种环、无菌培养皿、5支盛有4.5mL无菌水的试管、试管架、恒温培养箱、酒精灯、马克笔。实验步骤涂布平板法培养皿、吸管和试管编号：取6只无菌的培养皿，分别标号10-3、10-4、10-5 三种稀释度，各两皿（标准操作为每组三个皿，此处只为练手用两个皿）。将5只试管分别标注1,2,3,4,5表示稀释倍数。将6只吸管分别标记1,2,3,4,5,6，以方便吸取菌液。制备无菌平板：点燃酒精灯，将融化并冷却至50℃ 左右的培养基（手触摸不烫手）倒入无菌培养皿中，倒的时候右手握住三角瓶的瓶身或者是瓶底，不要握住瓶口，因为倒平板时要先将瓶口加热，用手握住瓶口容易烫伤并且也握不稳。操作过程中要用左手食指和大拇指拿稳皿盖，剩下三个指头拖住皿身，使其尽量水平在酒精灯附近操作。倒平板的时候大约每个倒15~20ml,太少了涂平板时容易涂破，太多了造成浪费。倒完后将培养皿盖上平行沿着桌面慢慢推向桌子里面。平置待凝。稀释菌液：。取5支盛有4.5mL无菌水的试管，稀释倍数依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。用1ml无菌吸管（看清吸管的量程）吸取0.5mL已充分混匀的大肠杆菌菌液（待测样品），放至装有4.5ml无菌水带有标记1的试管中，此即为10倍稀释。将10-1稀释的试管振荡使菌液充分混匀。另取一支1mL无菌吸管插入1号试管中吸取10-1已充分混匀的菌