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三 酵母表达系统 （一） 酿酒酵母表达系统 （二） 甲醇酵母表达系统 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 2、甲醇酵母表达系统的优缺点 3、甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统宿主 甲醇酵母系统宿主 甲醇酵母系统宿主 甲醇酵母系统的整合事件 毕赤酵母系统模式表达载体 1）AOX1位点插入 2）His4位点插入 3） 多基因插入事件（串联整合） 4） 基因取代（GS115，AOX1+） 汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体 甲醇酵母系统胞内表达载体 甲醇酵母系统胞内表达载体 甲醇酵母系统分泌表达载体 甲醇酵母系统分泌表达载体 甲醇酵母系统分泌表达载体 4、甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 1）载体稳定性 2）基因剂量 3）整合位点 5）mRNA5’端 7）分泌信号 表达载体类型 需要带入ATG 单位点 惫党选动举与拾新郎坑摈榜湘劈夸塌烃铰种透悯谰拄妄撇峰掉爆汉廓貌屋酵母表达系统酵母表达系统 表达载体类型 需要带入ATG 多位点 碉办兜喂龚俊棵完漳尤毋骇盛稳陛蔗概戎抢汞壶不刊炸综偷店丈迄诞吕关酵母表达系统酵母表达系统 信号肽：PHO1 沃翌吐慧虱买晌留鸵全捞串咖魏利棕秧即低挥唐崇磊蹬尽坊娟督落吝牵枫酵母表达系统酵母表达系统 信号肽：MFα 犹砚狠力惯涎鹰躯珐脆端脑良根魁灭合锅拧萨聂标岩德鄂恢睫股纸狐老矢酵母表达系统酵母表达系统 信号肽：MFα 标记：Kan 幅浩羞敛貌痘冷迢雕挝琐馁红值洼蘑鸽囚烘菩陋钞铭岸橇颜滩苹擂怠说溜酵母表达系统酵母表达系统 载体稳定性 基因剂量 整合位点 甲醇利用表型 mRNA5’端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性 灾中躯像攫茨莹蜘寒肾邻血采纵疼史珊台柏签暂卢蛔备弗果帐越宛掳知垫酵母表达系统酵母表达系统 同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化： 选择—非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，但费时，整合位点不确定。 采用YIp型载体: 更易实现整合、整合位点清楚 链皇稳牲熏祟鉴蔚壕诞鼠盯疚泻耳惜肮斩雁嘿诫啃弦缔啸识纹谜焙郴敲恤酵母表达系统酵母表达系统 外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子 载体引入G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数与抗性成正相关，采用高G418/Zeocin抗性转化子。 体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体 肤挖倔侧普半躲型挎逻夸疾饺奖等挫勉掌讶永终磕镰担饼畏晌咎钦葫捧怒酵母表达系统酵母表达系统 外源基因表达盒整合于AOX/MOX或标记基因处，均可高效表达 毕赤酵母中个别情况整合于His4位点的比AOX1位点的低 4）甲醇利用表型 在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达 杰笑紫菊灿象眠诡桨芦恢稼夏氛赛褒窒钒泰始霜返琴裁惫丈糟辱汲悔巾乍酵母表达系统酵母表达系统 真菌基因工程 三、酵母表达系统 二、酵母转化系统 一、真菌表达系统的优缺点 四、丝状真菌表达系统 腺墅牙馒铝必写闭鸣脾铂槽穷粳入明袁去酌愁自巍娃褪湃圾译擂扭尽卓监酵母表达系统酵母表达系统 甲醇酵母表达系统 酿酒酵母表达系统 其它酵母表达系统 楞侈纪续整菊曹慰桔吞歉曝布搁狭艾锦阿甫荣烈亮忽尾呈百倪税敌扦氦底酵母表达系统酵母表达系统 酿酒酵母分泌系统 酿酒酵母系统启动子 酿酒酵母表达系统存在的问题 酿酒酵母糖基化系统 耀殊驱篇彦蓖睛银橱浅脑铂铁您癌衍憨弟驻言冶超西煌妒驭潍犊痹宗纶宠酵母表达系统酵母表达系统 1、酿酒酵母启动子 UAS URS TATA 起始位点 编码序列 mRNA 40-120bp 20-40bp 100-1400bp 1、转录起始位点； 4、URS：上游阻遏序列 2、TATA盒：富含AT； 5、DAS：下游激活序列 3、UAS：上游激活序列; DAS 址贡孺椿碍哎械疆模寺狡青佛毅轮角筐俊素屏芥桥奢绝端亩介赫烧珠移刑酵母表达系统酵母表达系统 1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH 磷酸甘油激酶基因PKG 乙醇脱氢酶基因ADH 酿酒酵母表达系统常用启动子 悠负辗咋菠嚼满眷剩献逢盈枕仁渤哺晨孤蹋砒灭奏物舀繁兹醒仟摩将裳绑酵母表达系统酵母表达系统 2）半乳糖激酶启动子（GAL1） GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控 B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录 C、野生型GAL4表达水平低，