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杨树MYB基因家族成员PtMYB的克隆1.1 目的基因
1.1.1
杨树的基因PtMYB1470(1900bp)
2 PCR反应
2.1 反应体系
2.1.1
Components Volume (20(L) ddH2O 13.2(L 10×PCR Buffer 2(L 2.5mM dNTPs 1.6(L 上游引物(10pmol/(L) (L 下游引物(10pmol/(L) (L DNA模板 (about 100ng) Taq(4,5units/(L) 0.2(L Total 20(L 2.1.2 引物序列
Forward Primer: 5- GAGCTCATGGTAAGCTCATTAGGAG -3
Reverse Primer: 5- GGTACCTCATTGTTGATCTATTTCTGT -3
2.2 PCR反应条件
2.2.1 94℃5min，(94℃30s，58℃30s，72℃1min)×30个循环，@72℃ for 7min.
2.3 结果
2.3.1琼脂糖凝胶电泳
2.4 结果分析
2.4.1 从图中可见第五道为2000marker，第78有条带，说明PCR成功。
3 PCR 产物与T－载体连接
3.1 反应体系
3.1.1
Components Volume ((L) ddH2O 2 (L/（0 (L） 10× ligation buffer 1 (L PCR product 6 (L/（8 (L） pGEM-T easy vector 0.5 (L T4-DNA ligase 0.5 (L Total 10 (L
12-16℃连接过夜。
4连接产物转化感受态细胞
4.1反应步骤
4.1.1
将连接产物与感受态细胞混合，冰上放置30min；
4.1.2
于42℃热激90s后迅速放冰上2min;
4.1.3
加入1mL LB(不含氨苄青霉素)，混合后于37℃保温1hr;
4.1.4
4000 rpm离心4min，吸取上层液体LB直至管内体积约为150 (L左右，用吸头轻轻悬浮混匀，在含100 g/mL 氨苄青霉素的LB固体培养基平板(直径7cm)表面涂30 (L x-gal (20mg/mL, 用二甲基甲酰胺配制)和3 (L IPTG (200mg/mL), 然后涂布转化后的细菌. 37℃培养12-16h。
5 检测
5.1 PCR
5.1.1
挑取分离良好大小均匀的菌斑分别置于盛有20(L液体LB洁净的离心管中，混匀后，取1-2(L做PCR反应模板。
5.1.2 反应体系
Components Volume (20(L) ddH2O 14(L 10×PCR Buffer 2(L 2.5mM dNTPs 1.6(L 上游引物(10pmol/(L) (L 下游引物(10pmol/(L) (L DNA模板 (about 100ng) Taq(4,5units/(L) 0.2(L Total 20(L 5.1.3 反应时间和退火温度
94℃5min，(94℃30s，58℃30s，72℃1min)×30个循环，@72℃ for 7min.
5.2 PCR结果
5.2.1
5.2.2
图中可见两条清晰条带为15000，2000marker，凝胶底部没有见到阳性条带。
。。。。。。
致谢 谢谢安老师的精心指导！
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