02 - 1 体积排阻色谱与光散射技术 SEC-MALS 2014.pptxVIP

Size Exclusion Chromatography with Light Scattering Detection(SEC-MALS)Light Scattering UniversityWyatt Technology CorporationCHINA主要内容SEC技术与SEC-MALS技术仪器参数确定小 结多角度光散射法：两种测定模式单机模式 (Batch mode)Mw (weight-averaged molar mass)，Rz (z-averaged RMS radius) ， A2无法测定：样品多分散性系数（ PDI ）；联机模式 (Online mode, flow mode)Molar Mass，RMS ，Distributions，PDI；什么是 SEC-MALS ?SEC = Size Exclusion Chromatography（体积排阻色谱）Size Exclusion Chromatography (SEC) ：基于高分子分子尺寸大小不同而分离的色谱法。（分子尺寸大小：/wiki/Hydrodynamic_volumehydrodynamic volume.）MALS = Multi-Angle Light Scattering（多角度光散射）SEC-MALS: 多角度光散射与体积排阻法联用技术体积排阻色谱传统SEC 假设弊端传统SEC 假设待测样与标样性质相似：构象相似；密度相似；与柱填料无任何相互作用。Size exclusion chromatography of native and reduced, carboxymethylated RnaseAdapted from “Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions” by J. Wen, et al., Anal. Biochem. 240 155–166 (1996).高分子表征的需要多分散性样品: Mn, Mw, Mz, PDI (Mw/Mn)单分散性样品: 检测，识别聚集体以及各组分的数量。MwMwRILSRILSBSADextran典型光散射与色谱联用配置SEC - MALS 测定法几点建议对于水相体系，建议使用0.1 μm 对流动相过滤；而对于有机相体系，建议使用0.2 μm 对流动相过滤；使用在线脱气装置（In-line degasser）；添加在线过滤器（ In-line membrane filter ）： 水相体系：PEEK 材质在线过滤器；有机相体系：不锈钢材质在线过滤器； 逐步增加或降低流速，切不可大幅度调整流速；* 以上建议有助于延长泵、柱子的寿命（即使不使用光散射仪）。摩尔质量 - 定义Number average molar mass:Weight average molar mass:Z-average molar mass:色谱洗脱曲线中，每一洗脱体积其摩尔质量由光散射仪测定。色谱洗脱曲线中，每一洗脱体积其浓度由浓度型检测器测定。范例：摩尔质量计算范例:2 个分子 (“1-mer” 和 “9-mer”)相对分子质量分别是1和9ass多分散性样品的摩尔质量MwMpMzRIMnLSMn Mv Mw MzMw 直接有LS测定良好的SEC分离效果是精确测定摩尔质量的重要前提。均方根半径 （旋转半径）Mean Square Radius:单分子链中质量为mj链段mjrjRoot Mean Square (rms) Radius rg: 多分散性高分子：Z-average Mean Square Radius z-average mean square radius 直接由MALS测定 。Astra 直接计算出数均、重均以及z-均方根半径。 模板参数创建与系统有效性确认模板参数创建（Template Generation ）:归一化系数（Normalization coefficients）激光光电二极管检测能力差异修正延迟体积（Alignment ）：检测器间管路体积。宽峰校正（Band broadening）：样品稀释效应修正。仪器系统有效性确认（System Validation）建立仪器参数: “第一针” -- BSALS 90°UVASTRA 通过仪器配置自动识别、标记不同仪器、并存储数据。也可以支持第三方检测器如UV、RI等。数据分析- Baselines设定LS与浓度信号基线设定基线时，其应覆盖可能的基线漂移区。 数据分析 – P