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酶学分析技术 主要内容第一节 酶活性测定的基本知识第二节 酶活性单位的计算与校准第三节 酶活性的测定 第四节 代谢物的酶法检测酶（enzyme）的本质： 由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂 酶的特点：高度特异性、高度不稳定性，高效性、可调节性 酶的应用： 酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临床诊断和疗效判断第一节 酶活性测定的基本知识EE绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法 酶测定简介内容：一、酶活性二、酶活性单位与酶活性浓度三、酶促反应进程 四、酶促反应动力学 一、酶活性定义：酶活性（enzyme activity）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。 表示方法： 　或　 式中v：反应速率，[P ]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。 二、酶活性单位与酶活性浓度（一）酶活性单位定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。 表示方法：惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间）国际单位IU（μmol/min）Katal单位（mol/s） 1．惯用单位： 20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位 ALP的金氏单位（King）氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen） 举例：金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.82 ? 10-4μmol NADH为一个卡门氏单位特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较少。IFCC,2001年37℃2.国际单位IU（μmol/min）定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1μmol底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1μmol/min。 3．Katal单位 定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的酶量。1Katal＝1mol/s。 IU与Katal单位的关系：1katal = 60×106IU，1IU = 16.67nkatal （二）酶活性浓度 酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位。国际单位用IU/L或U/L表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性. 吸光度A非线性期延滞期线性期 t1t2 时间t 图5-1　酶促反应进程曲线三、酶促反应进程 以产物生成量（或反应物减少量）为纵坐标、反应时间为横坐标作图所得到的一条曲线，称为反应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲线） （一）延滞期（lag phase、延迟期 ）特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟 吸光度A非线性期延滞期孵育期延滞期线性期 t1t2 时间t 图5-1　酶促反应进程曲线R1R2（二）线性期特点：可代表酶促反应速度此阶段酶促反应速率基本保持恒定；对底物而言，为反应速率与底物浓度[S]的零次方成正比的零级反应，即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比 ； 此时底物的消耗量小于5%，反应速率为反应初速率。酶活性浓度越高，线性期就越短 线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受的程度 。 线性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％ 线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于15％，否则判为非线性（三）非线性期（偏离线性期、平坦期 ）进入非线性期的原因： 反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。特点： 若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度[S]的一次方成正比，为一级反应。四、酶促反应动力学研究内容： 研究酶促反应的速率及其各种影响因素（如底物浓度、酶活性浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）的科学 研究意义: 指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最适pH、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活性或代谢物浓度。（一）酶促反应酶促反应式K4米氏方程：（二）Km的含义与意义1．Km的含义:　 当Km=[S]时， ，可见Km值等于反应速率达到最大反应速率Vmax一半时的底物浓度。2．Km的意义 Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关反映酶对底物亲和力的大小 选择酶的最适底物或天然底物 计算不同底物浓度时的反应程度 鉴别酶的种类 判断可逆反应的速率