树突状细胞幻灯片.pptVIP

树突状细胞(dendritic cell,DC) 是一类具有树枝状突起的抗原呈递细胞，其分布广泛，由骨髓中的髓性多能干细胞发育而成，在免疫应答过程中至关重要。它是原发性混合淋巴细胞反应中的主要刺激细胞，可激活Th 细胞发生增殖反应，而且还能刺激产生TC 细胞。树突状细胞呈递抗原给T 细胞提供稳定的微环境。 基本原理细胞因子GM-CSF 和IL-4 使血液中单核细胞分化成树突状细胞，并用IFN-α促进树突状细胞的成熟。 试剂和材料● 新鲜的外周（肝素）抗凝血液● 淋巴细胞分离液。无钙镁HanKs(CMF-HanKs)液● 制剂：人重组GM-CSF(hrGM-CSF)、hrIL-4、hrIFN-α。●培养液：（1） RPMI1640 全培基：RPMI1640+10% 胎牛血清（ FCS、热灭活）+2mmol/LL-谷氨酰胺+100IU/ml 青霉素+100μg/ml 链霉素+1g/L 非必需氨基酸+1 mmol/L 丙酮酸钠+5×105 mol/L 2 巯基乙醇。（2） RPMI1640/IL-4/GM-CSF:即RPMI 全培基+IL-4(40ng/ml)+GM-CSF(50ng/ml).（3） RPMI1640/IFN-α:即RPMI 全培基+ IFN-α（1 -10ng/ml）。 1.制备单个核细胞； 2.调整单个核细胞浓度为1*106/ml,加入含hrIL-4、GM-CSF的RPMI1640进行培养，5%CO2,37℃,3天。 3、培基第3 天换液，轻轻吸去原培养液，加入等量含有IL-4 和GM-CSF 的新鲜1640 培氧液，继续置CO2 孵箱中培养。4、 促树突状细胞成熟：单核细胞经与IL-4 和GM-CSF 的共同孵育，7 天左右使其分化成树突状细胞，但并未成熟。此时轻轻吸去含有IL-4 和GM-CSF 的1640 培养液，更换等量的含有IFN-α的RPMI1640 培养液，继续置5%CO2 孵箱中，37℃培养，至第9 天时可获得成熟的树突状细胞。 小鼠淋巴细胞的分离与培养 1. 拉颈处死小鼠，置70%酒精中浸泡5分钟消毒，然后移入超净台。 2. 打开腹腔，无菌取出小鼠脾脏，放入盛有5-10mlDMEM不完全培养液的平皿中轻轻漂洗，并细心剥除脾脏周围的结缔组织。 3. 将脾脏移入另一个盛有5-10ml DMEM不完全培养液的平皿中，轻轻漂洗后置于100目细胞筛用滴管拉碎，使脾细胞通过筛孔被挤压入培养液中，反复冲洗，以取得单个细胞悬液。　　 小鼠淋巴细胞的分离与培养 4. 将脾细胞悬液缓缓加入到已装有淋巴细胞分离液的10ml离心管中（脾细胞悬液与淋巴细胞分离液体积比为1:1），然后2000rpm/min离心20分钟；5. 收集分离出的脾细胞，置于10ml的离心管内加入DMEM不完全培养液吹打。取少量用于显微镜下计数，同时1500rpm/min离心10分钟，弃上清； 加入适量完全培养液（DMEM液+10%小牛血清），将细胞重悬，调整细胞浓度为1×106/ml。6. 然后移入培养瓶，放入37oC ，5%CO2培养箱培养。 外周血单个核细胞的分离—密度梯度离心法 原理 根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同的分布位置。利用此原理可设计一定比重的液体界面，将外周血中各种不同比重的细胞通过离心沉降而达到使其彼此分离的目的。已知人类淋巴细胞和单核细胞的比重大约在1.075~1.090之间，而红细胞与粒细胞的比重均大于1.090。因此，若用比重为1.077±0.001的分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集外周血单个核细胞。 器材 （1）水平式离心机（2）显微镜（3）血球计数板、血盖片（4）载玻片、盖玻片（5）定量移液器、洗耳球（6）刻度离心管（7）试管、滴管、橡皮滴头（8）小滤纸、擦镜纸 试剂 （1）抗凝全血（临时抽取）、40倍稀释的全血（计数用）（2）淋巴细胞分离液（市售，比重：1.077±0.001）（3）Hanks液（4）白细胞稀释液（5）0.5%胎盘蓝 操作步骤 1.在已含1ml抗凝全血的试管内加入1ml Hanks液，混匀，然后用滴管将此稀释全血沿盛有1ml淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。 2.将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm）20分钟。 3.用计数板在显微镜下计数40倍稀释的全血，计算出其中的白细胞总数（/ml）及单个核细胞总数（/ml）。 用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细胞），吸出界面层细胞，移入刻度离心管内。 在该细胞收集管内（即刻度离心管）加入Hanks液，用滴管轻轻上下冲洗混匀，然后在离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，再用Hank