细胞生物学实验10,基地,01111166,王宪宁幻灯片.pptVIP

植物细胞骨架的光学显微镜观察 生物学基地 王宪宁 2013／4 实验目的 观察光学显微镜下细胞骨架的结构，了解显示植物细胞骨架的方法及其原理。 实验原理 细胞骨架包括微管、中间纤维、微丝。当用适当浓度的TritonX-100处理时，可将细胞内大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却被保存，经过固定和考马斯亮蓝R250染色，从而在光镜下观察到细胞骨架的网状结构。 实验用品 ㈠器材：显微镜、50ml烧杯、滴管、容量瓶、载玻片、盖玻片、镊子 ㈡试剂：⒈M—缓冲液;50mmol/L咪唑，50mmol/L KCL;0.5mmol/LMgCL2,1mmol/L EGTA(乙二醇双（a-氨基乙酸）醚四乙酸），0.1mmol/L EDTA,1mmol/L巯基乙醇或DTT(二硫酥糖醇） ⒉6mmol/L PH6.8磷酸缓冲液。 ⒊1% TritonX-100，用M—缓冲液配。 ⒋0.2%考马斯亮蓝R250，其溶剂是甲醇46.5ml,冰乙酸7ml ,蒸馏水46.5m. ⒌3%戊二醛，用6mmol/L磷酸缓冲液（PH6.8)配制。 ⒍5%、7%、95%乙醇。 ⒎叔丁醇、正丁醇、二甲苯、树胶。 ㈢材料：洋葱鳞茎。 试剂的作用 细胞骨架在通常情况下不稳定：如低温、高压、饿酸处理等。当用适当浓度的TritonX-100处理细胞时，能溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏显得更清晰，M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，经考马斯亮蓝R250染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示。 各个试剂的作用 PBS是生物学常用的缓冲液，可以依照不同的用途配成不同pH值的，实验所用的PBS的渗透压与植物细胞相近，不会造成细胞的吸水或失水，影响细胞状态，进而影响实验结果。第一步一般都是洗，主要是冲去灰尘或其他颗粒，另外稀释样品处理时渗出的植物汁液（比如用洋葱的话，撕皮的时候皮上也许多少会有沾点洋葱汁），这些汁液里面成分复杂，有可能影响后面的试剂效能，所以先用PBS洗一次。 M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在M缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂EGTA 和EDTA螯合 Ca离子，溶液并提供Mg离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。 考马斯亮蓝R250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。 实验方法 ㈠取洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm^2大小）若干片温于装有PH6.8磷酸缓冲液的50ml烧杯中，使其下沉。 ㈡吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100 处理20-30分钟。 ㈢吸去TritonX-100，用M—缓冲液洗三次，每次10分钟。 ㈣ 3%戊二醛固定0.5-1小时（对照组开始处理） ㈤ PH6.8磷酸缓冲液液洗三次，每次10分钟。 ㈥用0.2%考马斯亮蓝R250染色20-30分钟。 ㈦用蒸馏水洗1-2次，材料置于载玻片上，加盖玻片，即可镜检。 ㈧如作永久制片，可使样品顺序通过如下试剂：50%乙醇，70%乙醇，95%乙醇，95%乙醇和叔丁醇混合液（1:1），每次5-10分钟，或正丁醇→正丁醇→二甲苯→二甲苯，每次5-10分钟。然后捞取样品，平展于载玻片上，中性树胶封固。 植物细胞骨架微丝结构图 植物细胞骨架微丝结构图