血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳幻灯片.pptVIP

血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 实验目的 掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质的原理和方法。 支持介质 醋酸纤维素是把纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯,将其涂布得到的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象；膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，分离速度快，电泳时间短；样品用量少，5μg的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。 　　 醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存。 实验原理 本实验是以醋酸纤维素薄膜为支持物的区带电泳。在PH8.6的缓冲液中，各蛋白均带负电荷，在电场中向正极泳动。由于血清中不同蛋白质所带的电荷数量及分子量不同，因此泳动速度不同，从而彼此分离。电泳薄膜经染色和漂洗，可清晰呈现五条区带！经洗脱比色或者薄膜经透明处理后扫描可以测定各蛋白组分的相应百分含量。 操作 点样 将醋酸纤维素薄膜小条浸泡于PH8.6的巴比妥缓冲液中，使之完全浸泡透。 将浸泡的薄膜取出，用滤纸吸去多余的水分，让薄膜的无光泽面向上，用有机玻片末端蘸取少量血清在距一末端1.5cm处点样。 电泳 将点样的薄膜无光泽面向下，置于电泳槽支架上，点样端置于负极。槽架上用4层滤纸做桥垫，膜条与滤纸必须贴紧，平衡5min后通电，电压110v电泳1h。 染色 电泳结束后，用镊子将膜取出，直接浸于氨基 黑10B中染1min，后置于漂洗液中反复漂洗至背景干 净为止。用滤纸吸干薄膜。 结果观察 一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区 带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2 球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。 临床意义 人血清中五种蛋白质的正常范围： 清蛋白 57－72％； α1球蛋白2－5％； α2球蛋白4－9％； β球蛋白 6.5－12％; γ球蛋白 12－20％。 肝硬化时清蛋白含量减少，γ球蛋白明显升高； 肾病综合症清蛋白含量减少，α2球蛋白和β球蛋白升高。 血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 实验目的 掌握血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的原理和方法 支持介质 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。对一般蛋白质不起分子筛作用。该凝胶适合于蛋白质、核酸的分离、纯化及鉴定。并广泛用于免疫电泳技术。 优点：近似自由界面电泳，速度快；电泳后区带整齐，分辨率高，重复性好；便于紫外监测及定量测定。 实验原理 血清中含有多种脂蛋白，不同脂蛋白由于其脂类和 蛋白质的组成、含量及比例不同，颗粒大小不一，故在 同一电场作用下泳动速度不等，从而可以分离。本实验 以琼脂糖凝胶为支持介质，先用脂类染料将血清进行预 染，使血清脂蛋白着色，然后将预染过的血清置于琼脂 糖凝胶板上进行电泳。切下各脂蛋白区带，加热溶解， 冷却后比色，或者用光密度计直接扫描。计算出α-脂蛋 白、β-脂蛋白和前β-脂蛋白的相对百分数。 实验试剂 巴比妥－HCl缓冲液(pH＝8.6，离子强度0.075) 称取巴比妥钠15.5 g，量取1mol/L HCl 12 ml，加蒸馏水至1 000 ml。此为电极缓冲液。 巴比妥－HCl缓冲液(pH＝8.6，离子强度0.05) 称取巴比妥钠10.3 g，量取1 mol/L HCl 18 ml，加蒸馏水至1 000 ml。用于配制琼脂糖凝胶。 0.8％琼脂糖凝胶 1％苏丹黑B的石油醚－乙醇（1 ：4，V/V）溶液 操作 1、预染血清 吸取血清0.2ml于一小试管中，加入苏丹黑B染色液 0.02ml及无水乙醇0.01ml，混匀后置于37℃水浴中预染 30min。离心(2000r/min) 5min以去掉多余染料颗粒。 2、琼脂糖凝胶板的制备 将0.8％的琼脂糖煮沸溶解后，用刻度吸管吸取凝 胶溶液注于载玻片上，每片约注液3ml，趁热将盖槽用 的“Π”形有机玻璃盖在距载玻片一侧约1 cm处 。 实验结果 血液中的脂类除游离脂肪酸与白蛋白结合外，其余均与球蛋白结合成为脂蛋白，各种脂蛋白因其所含的脂类及蛋白质的量不同而不同。 临床意义 血清中一种或一种以上脂蛋白含量增高称为高脂 蛋白血症，可分为以下五型： Ⅰ型：出现乳糜微粒； Ⅱa型：β-脂蛋白含量升高； Ⅱb型：β-脂蛋白含量升高并伴有前β-脂蛋白升高； Ⅲ型：出现异常的宽β-脂蛋白区带； Ⅳ型：前β-脂蛋白含量升高； Ⅴ型：前β-脂蛋白含量升高并出现乳糜微粒； Ⅱ和