HPLC高效液相色谱培训--PPT.ppt

Tanghui.pha.shzu * Tanghui.pha.shzu * Tanghui.pha.shzu * Tanghui.pha.shzu * Tanghui.pha.shzu * Tanghui.pha.shzu * 高效液相色谱 High Performance Liquid Chromatography，HPLC 一、基本原理和特点： 基本原理：溶于流动相中的各组分经过固定相时，各组分与固定相发生相互作用，由于其性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。 二、高效液相色谱仪器 1、流程 溶剂 色谱泵 自动进样器 HPLC色谱柱 检测器 废液 数据处理系统 2、高效液相色谱仪组成 1、输液系统：高压输液泵（带脱气装置） 2、进样系统：耐高压的六通阀进样装置 3、分离系统：色谱柱 4、检测系统：紫外、二极管阵列、荧光、蒸发光散射等 5、数据记录处理系统 （l）紫外检测器 灵敏度高； 线形范围高； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 （2）二极管阵列检测器（DAD） 可实施一个样品的全波长扫描； 可同时给出紫外光谱和色谱图，便于组分定性和定量； 可进行峰的纯度检测； 可提供各种类型的色谱图（单波长色谱图、任意两个波长的吸收比色谱图、最大吸收波长色谱图以及总体吸收色谱图）。 （3）示差折光率检测器 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比； 几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7g/cm3。 主要缺点：对温度变化敏感，灵敏度低、并且不能用于梯度淋洗。 （4）荧光检测器 高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃、维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应； （5）蒸发光散射检测器 由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光检测器（光电转换器）等部件构成。 色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。 适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。 1、固定相： 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。 三、HPLC的固定相和流动相 2、流动相： 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中： 对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂； 对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂； 洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂的极性越强。下表列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的ε0值。在硅胶吸附剂中ε0值的顺序相同，数值可换算（ε0硅胶=0·77×ε0氧化铝）。 3. 对流动相溶剂的要求： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配，当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 （3）高纯度。由于HPLC灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。 （4）化学稳定性好。勿选与样品发生反应或聚合的溶剂。 （5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。 4、实验操作： 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 离线脱气：超声清洗仪 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 5、 洗脱程序： 等度洗脱 梯度洗脱 （1）改善分离，加快分析速度； （2）改善峰形，减少拖尾； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在柱上，保持柱性能长期良好