基因克隆原核表达-2002课件.pptVIP

基因克隆（分子克隆molecullar cloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。 二、克隆载体 据受体细胞的不同可分为： 1．原核表达载体系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。 2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。 二．原核生物基因结构和表达特点 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。 多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的mRNA 3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。 共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。 包括：调控区(调节基因，启动基因， 操作基因)、 结构基因： 5、原核生物中参与转录的基因结构： 启动子 终止子 启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40-60bp，富含A-T硷基对 共有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区： RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录 各种启动子启动转录能力不同。 启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列 终止子（terminator，T）:位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 富含GC的反向重复序列 富含AT的序列 转录形成发夹式结构 6、与转译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点 转译起始密码子AUG SD顺序（shine-dalgarno）： AUG上游3-11 bp 长约3-9bp mRNA与30s核糖体亚基间的识别与结合序列 三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件： 删除内含子和5’非编码区 外源基因置于强启动子和SD顺序控制下 维持正确开放阅读框架（ORF） mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素： 1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。 常见原核强启动子： Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导 Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。 Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。 PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。 * 基因的克隆与表达 山东大学医学院免疫学研究所 马春红 基因克隆(gene clonging) 基因表达(gene expression) -原核基因表达 -真核基因表达 基 因 克 隆 Gene Cloning 概述 克隆载体 受体细胞 体外重组的策略 基因克隆工作流程 一、概 述 1973年Cohen完成第一个基因工程实验 经体外重组获得杂合DNA 杂合子转化入大肠杆菌 所需元件： 限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞 基因克隆的核心-----体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 基因克隆的技术路线 目的基因 载体 体外重组 重组子（杂合DNA） 转化 受体细胞 筛选阳性克隆 大量扩增，获得子代DNA 三、受体细胞 1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。 2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性 四、体外重组的策略 1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 最方便简单 高背景-载体自身环化 双向插入 2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略 粘-粘连接：最有效、最快捷 粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平 2、平末端连接： 酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA 效率低，酶用量大 3、人工接头连接 人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段 4、T-A克隆 T-vector两条链的5’端含有一个游离的T PCR过程中，增加延伸时