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大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质 纯化的DNA pol I由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，分子质量为109kD。每个大肠杆菌细胞中含有400个分子，在37℃条件下每分钟能催化667个核苷酸掺入正在生长的DNA链。 DNA pol I在空间结构上近似球体，直径约65?（1?=10-10m）。在酶的纵轴上有一个约20?的深沟（cleft），带有正电荷，这是该酶的活性中心位置。 大肠杆菌DNA聚合酶I （E.Coli DNA pol I）是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E.Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力： 5′- 3′聚合酶活性 以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的3′末端，并不断延伸。 5′- 3′外切酶活性 将双链DNA中游离的5′末端逐个切去。 3′ - 5′外切酶活性 将游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。 5′ CCG 3′ GGCTATCGGA CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ A T A G CCT 5′ CCGATAGCCT 3′ GGCTATCGGA 5′ CCGATAGCCT 3′ GGCTA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ T 大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途 A. 制备高比活度的DNA探针 利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。 B. 用于DNA连接后的大缺口填充 利用5′--3′的聚合酶活性。 C. 用于DNA的序列分析 利用5′--3′的聚合酶活性。 大肠杆菌聚合酶I的应用示例 CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ 缺口转移 (Nick translation) CCG GGCTATCGGA CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ A T A G CCT 缺口转移 (Nick translation) 1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶） 第三节 DNA聚合酶及其应用 Klenow片段的主要用途 Klenow片段大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段（76kD）酶分子，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→ 5 ′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。 Klenow片段的主要用途 修补限制性酶消化DNA形成的3′隐蔽末端 标记DNA片段的末端 cDNA克隆中第二链cDNA的合成 DNA序列的测定 GAA CTTAA 1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶） 第三节 DNA聚合酶及其应用 T4DNA聚合酶的特点 T4DNA聚合酶是 从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它和Klenow片段相似，也是一条多肽链，分子质量亦相近，但氨基酸组成不同，它至少含有15个半胱氨酸残基，也一样具有5′→3′的聚合酶活性和3′→ 5′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。 特别是，T4DNA聚合酶还有第三种活力—取代反应： 如果反应体系中仅存在一种dNTP，这时T4DNA聚合酶就会表现出3′→ 5′外切酶活力，从双链DNA的3′开始降解，直到露出和该dNTP互补的碱基为止，然后就在此位置发生合成和取代反应。 CGTCGC GCAGCG CGT GCAGCG dTTP Mg++ CG GCAGCG dTTP Mg++ T4DNA聚合酶的用途 1、以填充反应标记有5′端延伸的双链 DNA片段 2、以取代反应标记延伸末端或平头末端 的双链DNA片段 3、用于DNA序列分析 1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶） 第三节 DNA聚合酶及其应用 逆转录酶—Reverse transcriptase 逆转录酶是 一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA(complementary DNA).实际上，它也是一种RNA依赖的DNA聚合酶。 逆转录酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的《Nature》杂志上。 主要用途是 将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。 3’ AAA