蛋白质理化性能与纯化课件.ppt

1、可逆沉淀 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。 盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）使蛋白质沉淀析出的现象（水与离子的相互作用增加了蛋白质表面的疏水补丁的相互作用；同时瓦解了以电荷为基础的蛋白质分子之间的作用）。 盐溶：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，此现象叫盐溶。 2、不可逆沉淀 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 透析的示意图 电泳上样和电泳图 走电泳 蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。 利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。 AFC是基于固定相的配基与生物大分子之间的特殊的生物亲和能力的不同来进行生物大分子相互间的分离。 离心机和离心沉降法分离蛋白质 氨基酸和肽末端测定法 离子交换色谱分析蛋白质的氨基酸组分 （八）应用物理学、生物信息学原理可进行蛋白质空间结构测定或预测 1.二级结构测定 通常采用圆二色谱（circular dichroism,CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。a-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰三个成分；而b-折叠的CD谱不很固定。 2. 三维空间结构测定 X射线衍射法（X-ray diffraction)； 核磁共振技术（nuclear magnetic resonance,NMR) 这两种方法是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。 3. 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质的空间结构； 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构预测。 IEC是利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离 凝胶过滤或体积排阻色谱（ SEC）或分子筛层析(molecular sieve filtration) 是利用各蛋白质分子大小不同分离； HIC 是基于用适度疏水性的固定相，以含盐的水溶液作为流动相分离； 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。 （六）利用蛋白质颗粒沉降行为不同可进行超速离心分离 * 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 （七）用化学或反向遗传学方法可分析多肽链中氨基酸序列 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 * 第六节 蛋白质的理化性质与分离纯化 The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein 一、理化性质 （一）蛋白质的两性电离性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 （二）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万或更大，由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。 蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 * 蛋白质胶体稳定的因素:颗粒表面电荷、水化膜