第七章植物细胞及原生质体培养.pptVIP

第一 节植物细胞培养 一、单细胞培养（通常以叶片为材料） （一）单细胞的分离 1、机械法（用刀片刮叶、叶片研碎离心）2、酶解法 （二）单细胞培养培养培养方法：平板培养、看护培养、微室培养、条件培养基培养法。 二、细胞的悬浮培养(cell suspension culture) 特点：细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。 第二节 植物细胞培养的应用 1、细胞培养产生次生代谢产物：生产天然的植物成分（药品、香料、染料、糖类等）；生物转化得到中间产物；细胞的工厂化生产。 2、是细胞生物学研究方面的一项重要技术。 3、为细胞融合于细胞于细胞杂交创造条件，可产出新品种。 4、为基因转移创造条件。 5、筛选突变体（体细胞无性系变异）。 思考题： 1、有关名词解释 2、简述分离细胞的方法。 3、单细胞培养的基本方法有几种？ 4、简述植物原生质培养及细胞融合的作用。 （三）原生质体培养： 1. 培养方法： （1）固体培养：平板培养法，1. 2%琼脂。 （2）液体培养：A. 浅层培养法: 其过程是将1mL原生质体悬液置于直径4cm培养皿或25mL三角瓶中使成薄层后于培养箱中培养，初期振摇1-2次，防止粘壁；B. 固液结合培养法：在混好原生质体的固体培养基表面加一层相同成分的液体培养基进行培养，效果较好。 液体振荡培养 叶肉原生质体愈伤组织 2. 培养条件： 密度： 平板培养103~104个/ml,液体培养104~105个/ml 温度： 多数为25-28 oC, 少数16~37 oC 光照：2800 lx 连续光照，多数要求黑暗或弱光 3. 细胞壁再生及细胞分裂：l-3天即再生新细胞壁，表现为体积增加、膨大，再由圆变椭圆。可用质壁分离法证实。也可用0. 1% ST型或WBL型荧光增白剂染色，经前者染色，有细胞壁者在荧光显微镜下呈蓝色荧光。经后者染色，有细胞壁者发射绿色荧光。在原生质培养过程中，胞质增加，液泡减少，叶绿体或颗粒内含物分散于泡质中或围绕于细胞核周围，常在1-2周内发生第一次分裂。不同细胞分裂频率不同。 2、悬浮培养类型： （1）分批培养(Batch culture)：在一个封闭的系统中进行细胞培养，当培养物增加到一定量时，需继代培养，即取出少量培养物转接于新鲜培养液中。 特点：培养基体积固定；培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化， 呈S增长；必须适当搅拌 。细胞生长各个时期的特点： 缓慢期：生长逐渐缓慢，培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少； 滞后期（延迟期）：细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关； 对数生长期：细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变； 直线生长期：细胞生长和发育最明显的时期； 静止期：生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。 滞后期 对数生长期 直线生长期 缓慢期 静止期 培养时间 培养细胞数目 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 继代 继代方法： 用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。 （2） 连续培养(Continuous culture):是用一定容积的非密闭系统进行细胞培养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排除系统。分为封闭型和开放型连续培养两种。 连续培养（Continuous culture） 加入培养基 排出培养基及其培养物 二者体积相等 分：开放式连续培养（Open C.C）封闭式连续培养（Closed C.C） 开放式和封闭式区别 封闭式中：排出液中的细胞用机械方法收集后，又放入原培养基，所以其培养细胞数目不断增加； 开放式中：在注入新鲜培养基的同时，培养细胞随同培养液一起流出，培养细胞数目保持恒定；通过调节流入和流出的速度，使培养物的生长速度永远保持接近最高值的恒定水平上。 （3） 半连续培养：是利用培养罐等装置进行细胞大量培养的一种方式。在半连续培养时，当培养容器内细胞增殖到一定数量后，倒出一半细胞悬浮液于另一培养罐等容器，再分别加入新鲜培养基继续培养。半连续培养能够重复获得大量均一的培养细胞供进一步利用。 3、悬浮培养中细胞生长量的计算 细胞计数：5％铬酸或0.25％果胶酶使悬浮细胞团分散用血球计数板进行。 细胞密实体积（PCV）：将体积已知、均匀分散的悬浮液放入一个 15mL 的离心管中，2000转下离心，用每mL培养液中细胞总体积的mL数表示。 细胞鲜重：细胞培养物过滤，洗去培养基，真空抽虑，称重。 细胞干重：以每毫升培养物或106个细胞的重量表示。60℃干燥12小