大肠杆菌碱性磷酸单脂酶基因.docVIP

基因工程综合性教学实验 大肠杆菌碱性磷酸单脂酶基因 克隆 表达 纯化 班 级 生科02 姓 名 李 婷 学 号 021579 组 员 杨 梓 生 物 工 程 学 院 华 东 理 工 大 学 二○○五年六月 目 录 1 前言 1 2 材料与方法 4 2.1 材料与仪器 4 2.2 DNA酶切的实验步骤 5 2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳的实验步骤 5 2.4 DIG分子杂交的实验步骤 5 2.5 DNA制备的实验步骤 7 2.6 目的基因PCR克隆的实验步骤 8 2.7 基因片段的回收――Kit回收法的实验步骤 9 2.8 DNA连接的实验步骤 9 2.9 转化的实验步骤 9 2.10 工程菌发酵的实验步骤 10 2.11 细胞破碎的实验步骤 10 2. 12 酶活及蛋白含量检测的实验步骤 10 2. 13 包涵体复性的实验步骤 11 2. 14 DEAE-32纤维素离子交换层析的实验步骤 11 2. 15 浓缩与透析的实验步骤 12 2. 16 SephadexG-75凝胶层析的实验步骤 13 2. 17 SDS的实验步骤 14 3 实验结果与分析 16 3. 1 碱性磷酸单脂酶基因在大肠杆菌染色体上的定位 16 3. 2 大肠杆菌碱性磷酸单脂酶基因的克隆 17 3. 3 大肠杆菌碱性磷酸单脂酶基因表达载体的构建 19 3. 4 大肠杆菌碱性磷酸单脂酶基因的表达 21 3. 5 大肠杆菌碱性磷酸单脂酶的分离纯化 22 4 总结与讨论 29 1 前言 碱性磷酸单酯酶（Alkaline Phosphatase EC3.1.3.1，简称：AKP）为金属酶，在磷酸盐代谢中起重要作用。该酶广泛存在于原核和真核生物各组织中。 含有碱性磷酸单酯酶结构基因phoA的菌体可分泌磷酸酯分解酶A（alkaline phosphatase Ⅲ）。在相同的细胞密度下，其所分泌的磷酸单酯酶活性为不含此种基因菌体的100~200倍。碱性磷酸酶phoA基因存在于许多菌种中，这些细菌将生成的phoA分泌到细胞外可使含有phoA基质（BCIP 或PNPP）的选择培养基呈现蓝绿色。 E．coli中含有此phoA基因，从TTG（Strat）到TAA（end）全长1484 bp，其启动子受phoA、phoM、proC和phoR基因产物的调节。在低磷酸盐条件下被诱导而大量合成碱性磷酸单酯酶，促进磷酸盐代谢；但在高磷酸盐条件下此反应则被抑制。 碱性磷酸单酯酶一般存在于外周胞质中。与其它分泌蛋白一样，是以前体的形式分泌的，在膜通道中最终形成成熟的碱性磷酸单酯酶，成为主要存在于质膜上的一种膜结合蛋白。该酶以二聚体形式存在，每条单链47.05KD。这两条链的蛋白序列完全相同，但二级结构有细微差异。每条单链含有三个间隔很近的金属离子：两个Zn2+，一个Mg2+，还有一个磷酸基团。在该酶的活性中心含有丝氨酸残基。该酶二聚体的沉降常数为6.2S。金属螯合剂可除去锌离子而使酶失活。 磷酸酶的作用是将DNA末端中的5’-端磷酸基除去，使其5’-端变成了OH基。它有两个主要的用途：一是将载体末端的磷酸基除掉，避免在DNA重组时载体分子的自我连接；另一用途就是和T4多聚核苷酸激酶连用，用于DNA的末端标记。碱性磷酸单酯酶是一种非特异性的水解酶，能水解磷酸单酯键，但不能水解磷酸二酯键。它可作用于多种底物，最适温度37度，最适PH为10。在碱性条件下水解磷酸酯：单磷酸酯+水 醇+磷酸。 碱性磷酸单酯酶有很大的应用价值，因此我们学习大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因的克隆、表达和纯化的整个过程是有一定实用意义的。 在上游实验中，我们通过基因组DNA的制备、酶切、电泳、转膜、固定、杂交、显色等操作来实现碱性磷酸单脂酶基因在大肠杆菌染色体上的定位；通过PCR扩增、电泳、回收、连接、转化、扩增、快抽鉴定等实现大肠杆菌碱性磷酸单脂酶基因的克隆；通过快抽质粒、载体酶切、回收、连接、感受态