免疫实验设计高山.docx

染色质免疫共沉淀（X-ChIP）实验设计设计人: 高山 牡丹江医学院 硕士研究生ChIP是一种强大的确定蛋白或者组蛋白修饰在基因组上定位的实验方法。染色质被分离出来后采用抗体与抗原的结合来判定目的蛋白是否结合在特定的DNA序列上或者判定目的蛋白结合位点在全基因组范围的分布（微阵列或DNA序列）。这种方法具有空间性与时效性。该实验设计为如何在细胞中进行ChIP实验提供了详细的步骤。1交联和细胞收获。甲醛可以将蛋白质交联到DNA上。交联结果的好坏决定于交联时间的把握。我们建议样品交联的时间一般为2-30分钟。过度的交联会减少抗原的结合性和超声断裂的效率。抗原决定簇也会被掩盖。加入甘氨酸可以消除甲醛使交联反应终止。1.准备两个长满细胞的150cm2的细胞培养皿（1*107-5*107个细胞/皿）。将甲醛直接滴入PBS洗过的细胞培养皿中，使其终浓度为0.75%，然后在室温缓慢旋转10分钟，使蛋白和DNA发生交联。2 加入甘氨酸使其终浓度为125mM,在室温晃动孵育5分钟。3 使用10ml预冷PBS清洗细胞2次4 使用细胞刮将细胞收获放入5ml预冷PBS中，并转入50ml的管子。5.在皿里加入3mlPBS，将剩余的细胞转移到50ml管子里6 1，000g离心5分钟7.将上清倒去，使用FA裂解液将沉淀重悬浮（1x107cells/750μl).初始细胞要有1*107-5*107个，采用终浓度为0.75%甲醛和如上描述的甘氨酸处理。预冷PBS洗3次，1，000g离心5分钟，沉淀用FA裂解液重悬浮。2。超声破碎超声裂解细胞悬液可以将DNA均一的打断成500-1000bp的片段。不同的细胞系需要不同的超声时间才能达到最优效果。交联细胞要通过时间梯度的超声来选择最优超声条件。样品通过时间梯度，DNA的分离如部分3所描述。片段大小序在1.5%的琼脂糖凝胶上检测分析。如图一所示图一：2 超声破碎后，8，000g，30秒，4°C,离心。将上清移入新的管子中。开始准备进行染色质免疫共沉淀（IP）。3 每份超声样品取50ul，这时的样品标记为INPUT，用于定量DNA浓度和作为PCR的空白对照。超声后的染色质应立刻冻入液氮中或者储存于-70 °C可储存2个月。避免多次反复冻融。3 检测DNA浓度1 INPUT样品用于为后来的IP样品计算DNA浓度。DNA可采用PCR纯化试剂盒（加入70ul洗脱液，接着进入3.2a）或者采用酚/氯仿抽提（加入350ul洗脱液，接着按照3.2b进行）2 a.加入2ul RNaseA(0.5 mg/ml).加热至65 °C摇晃4-5小时或者过夜以逆转交联。DNA采用PCR纯化试剂盒中厂家说明进行纯化。样品冻存于-20 °C.样品之所以加入RnaseA是因为高浓度RNA会在使用PCR纯化试剂盒时干扰DNA的纯化。而纯化柱子的饱和度是既定的。2 b.加入5ul蛋白酶K(20 mg/ml). 加热至65 °C摇晃4-5小时或者过夜以逆转交联。采用酚/氯仿抽提的DNA使用乙醇沉淀于10ul的糖原(5mg/ml).中。100ul水重悬浮。样品冻存于-20 °C.样品采用蛋白酶K处理可使相邻肽段剪切成羧基团的芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸。蛋白质和DNA之间的交联通过DNA的纯化被打断。3 检测DNA浓度，取5ul纯化的DNA到995ulTE中得到一个原溶液的200倍稀释测其OD260。那么DNA的浓度就为OD260 x 10,000. μg/ml。这样就可计算出染色质制品的DNA浓度。4 免疫共沉淀1 从2.2得来的染色质制品，推荐每个IP样品都采用25ug的DNA的量。每个样品按1：10的量加入RIPA溶液。需要一个样本作为空珠子的对照。2 在除空珠子对照样品外每个样品中加入一抗，抗体的量按照以往经验来加，1-10ug的抗体/25ugDNA效果较好。3 加入20ul的 protein A/G珠子（预先用超声处理成为单链的鲱精DNA和BSA吸附，详见步骤4.3a）到所有样品总，4°C摇转IP过夜。3 a 将蛋白A/G珠子与单链鲱精DNA进行预处理。如果同时使用蛋白A珠子和蛋白G珠子，等体积混合这两种珠子使用RIPA溶液洗3次。除去RIPA溶液，加入单链鲱精DNA到珠子终浓度为75 ng/μl，再用BSA将珠子终浓度定到0.1 μg/μl。加入两倍珠子体积的RIPA溶液在室温孵育30分钟。用RIPA洗一次，然后加入同体积的RIPA。蛋白A珠子，蛋白G珠子或者它们的混合都可以使用。表格1显示了蛋白A和蛋白G珠子对于不同免疫球蛋白同型的亲和力。4 2，000g，1分钟离心蛋白A/G珠子，移除上清5 用1ml的Wash Buffer溶液清洗珠子3次，2，000g，1分钟离心，移除上清6 用1ml的Final Wash Buffer溶液清洗珠子1次，2