宏基因组实验计划.doc

宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划 起草人：李浩宇 宏基因组学研究方向及意义 研究：环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。 发掘：环境应激和应答基因的多态性。 探究：多态性基因的功能。 实验大体步骤： I.环境样品的采集： 1）避免人源污染采样的器具都要高温灭菌，采样过程中要戴手套。2） 样品的迅速处理保存。有条件最好用液氮运输，没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品，迅速用预冷缓冲液 (多为PBS)重悬，离心收集沉淀。分装成小份，冻存于液氮或者80 ℃ 冰箱中，避免反复冻融。如果后续用间接法提取总DNA 的话，此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，总DNA 的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。直接提取法的优缺点：直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等) 总DNA 的试验中。其最大的优点在于得率高，在某些环境样品总DNA 提取实例中，比间接提取法高数倍至数百倍。造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DNA；二是许多微生物与基质形成复杂的结构，间接提取法不易对其进行分离。在样品较珍贵时多采用此法。其缺点同样明显，所得DNA 的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保留下来，使得所得DNA 呈现黄褐色甚至黑色。可以考虑MoBio 和Epicentre(主要用于提取土壤样品)间接提取法的优缺点：间接提取法则既可以用来提取固相样品总DNA 也可以用来提取液体样品总DNA。在提取液体样品 (如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤的方式浓缩。与直接提取法刚好相反，其最大的优点在于提取DNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DNA 时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。其缺点是DNA 得率低。土壤DNA 直接提取法：(1) 从超低温冰箱中取出保存样品 (5 g)；(2) 于室温融化；(3) 加入13.5 m CTAB 抽提缓冲液和50 μ 蛋白酶K 贮存液；(4) 离心管于37oC 225 rpm 水平振荡30 min；(5) 加入1.5 mL20%SDS；(6) 65oC 水浴2 h，每隔15 min 轻轻颠倒数次；(7) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，转移至一个新的50 m 离心管中；(8) 沉淀中再加入4.5 m 提取液和0.5 m 20%SDS，轻轻涡旋至混匀；(9) 浸入液氮中冷冻3 min 后，于沸水中煮沸3 min；(10) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，与上次上清液合并；(11) 重复(8)、(9)、(10)一次；(12) 将三次提取所获上清液与等体积的苯酚：氯仿(1:1 v/v) 混合，摇匀后于4 12,000g 离心10 min；(13) 将上层水相转移至一新的50 m 离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀后于4 12,000g 离心10 min；(14) 再次转移上清至一新的离心管中，加入0.6 倍体积的异丙醇于室温沉淀1 h；(15) 室温12,000g 离心20 min；(16) 收集沉淀，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；(17) 向离心管中加入1 m TE，于4 放置过夜，分装保存于20 ℃。实验过程中的注意事项及一些技巧：(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔，避免剧烈震荡(试剂盒提取除外)。(2) 用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉，避免机械剪切。(3)酚氯仿抽提时，中间相一定不要吸到，宁可多丢弃一些。(4) 异丙醇沉淀时不要放在低温，0.7 倍体积室温沉淀足够了。(5) DNA 溶解时可以放在4 静置过夜，次日离心取上清去除杂质。(6) 水平震荡可以用左右的震荡器。DNA 间接提取法：抽滤的方式浓缩粗提DNA 的纯化采用直接提取法提取的总DNA 或多或少都含有腐殖质的存在。它的存在对后续的分子生物学操作会有影响，时常会导致PCR 扩增不出来，酶切困难，连接转化率低。需要进行纯化。纯化的方法胶回收，柱纯化，电泳/电洗脱，梯度离心。a 胶回收胶回收最大的优点在于快捷，可以在很短的时间内完成。纯化后的DNA 往往能够满足PCR 要求。但其缺点在于，膜截留式的纯化方式难免会对DNA 分子造成机械损伤，使得DNA 弥散，完整度下降。如果后续的实验室分析16S r DNA，则这种纯化方式不失为一种好方法。b 柱纯化柱纯化相对于胶回收来说更为快速，十几分钟内可完成。与胶回收相比，其纯化效果要差一些。但通常情况下，