实验三抗体形成细胞能力的检测——QHS和第3次免疫(免费阅读).pptVIP

实验三 体外检测细胞产生抗体的能力 ——QHS法第三次免疫  Complement-binding site Fab段 Fc段 C1q 结合位点被屏障 结合抗原之前 CH1 CH2 暴露的C1q结合位点 结合抗原之后 IgM CH3区，IgG CH2区 抗原+抗体 结合补体 抗原+抗体+补体 补体活化，形成MAC 靶细胞裂解 ( QHS——Quantitative Hemolytic Spectrophotometric determination ) 定量溶血分光光度计法体外检测 细胞产生抗体的能力 1. 原理： 抗原 SRBC 免疫小鼠 4 days later 浆细胞 IgM + SRBC 补体 分光光度计定量分析 Hb Hb Hb 脾脏 2. 材料： SRBC免疫小鼠 新鲜SRBC溶液 (1.5×108/ml) 经SRBC吸收的补体溶液 来自豚鼠血清 经SRBC吸收去除非特异性抗体 3. 方法： 取脾，以Hank’s 液漂洗 经200钼铜网，以针拴研磨脾脏成单细胞悬液 收集细胞悬液，加适量Hank’s 洗涤 离心1500rpm, 5min 1） 制备脾细胞 弃上清 细胞沉淀中加入4.5ml蒸馏水，用力混匀 40s 迅速加入0.5ml 9%NaCl 离心 1500rpm, 5min 弃上清，加入1.2ml Hank’s溶液 断颈处死SRBC免疫的小鼠 3. 方法： 2）抗原-抗体-补体反应： 脾细胞 Hank’s 1ml 加1ml SRBC 溶液 加1ml补体 彻底混匀 37℃孵育1h 离心，3000rpm，5min 分光光度计检测上清液413nm波长下的吸光值 C T 3. 方法： RBC WBC WBC WBC WBC 1mm 1mm 细胞浓度/ml = 4个大方格中的细胞总数/4 x 104 细胞浓度/ml = 5个中方格中的细胞总数 x 5 x 104 4. 注意事项： 新鲜SRBC溶液，用前晃匀 保持脾细胞活性 Test 2 第三次免疫 2. 方法: 脱纤维绵羊红细胞（SRBC） 加入3ml 生理盐水，混匀 2000rpm, 离心，5min 弃上清 制备绵羊红细胞溶液20%、25%、30%、40% 取0.1ml 皮下注射免疫小鼠 加入3ml 生理盐水，混匀 2000rpm, 离心，5min 弃上清 * 抗原进入机体后，可以刺激机体产生免疫应答，包括固有免疫和特异性免疫，其中特异性免疫中又可分为体液免疫和细胞免疫。体液免疫是由B细胞产生的抗体介导的。 * 抗体产生的过程，可以分为三个阶段，抗原的识别阶段，B细胞活化、增殖和分化阶段，效应阶段。B细胞分化为浆细胞方可产生抗体，因此又将其命名为抗体生成细胞。 * 抗体为四肽链的多糖蛋白，由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，根据各肽链的结构特点可以分为N端的可变区和C端的恒定区。可变区主要是与抗原表位相结合的区域，而恒定区是同种异型遗传标记存在的部位，并且介导抗体的多种生物学活性，激活补体等。抗体结构通过链内二硫键可将分为多个不同的球形功能域。IgG的CH2和IgM的CH3具有补体结合位点。 * 抗体在与抗原结合之前，呈T型，补体结合位点被屏蔽；与抗原结合后，补体结合位点暴露，具有激活补体的功能 * 单独的抗原抗体结合后，并不具有消除抗原的能力，需要其他免疫细胞或免疫分子的参与。如果反应体系中有补体的参与，则可以形成MAC，最终裂解靶细胞。 * 本次试验的原理是将绵羊红细胞注射小鼠4天后，取小鼠脾脏。 脾脏作为外周免疫器官，不仅是免疫细胞（T、B细胞定居的场所，而且使免疫细胞接受抗原刺激发生免疫应答的场所。 因此，SRBC免疫后小鼠脾脏中，SRBC 特异性的B淋巴细胞活化、扩增，并分化成为浆细胞，主要分泌IgM。因此，将脾细胞分离后，体外与SRBC、补体混合，即可发生抗原抗体反应，并进而激活补体成分，发生级联反应，溶解绵羊红细胞，释放血红蛋白，通过分光光度计检测OD值，可以达到定量的目的，继而反向评估机体抗体形成细胞产生抗体的能力。 * 处死小鼠，将其取右侧卧位固定在解剖台上，左上腹部开腹，取出长椭圆形脾脏，在平皿盖内加入少量Hank’s液体，清洗脾脏表面的脂肪组织和纤维，注意一定要去除干净，否则会影响单细胞的沉淀，丢失细胞。 在平皿的另一半中加入少量的hank’s液，将脾脏放在铜网上面，以针拴辗磨成单细胞悬液。 收集细胞悬液，加少量hank‘s液清洗铜网和平皿。 * 抗原进入机体后，可以刺激机体产生免疫应答，包括固有免疫和特异性免疫，其中特异性免疫中又可分为体液免疫和细胞免疫。体液免疫是由B细胞产生的抗体介导的。 * 抗体产生的过程，可以分为三个阶段，抗原的识别阶段，B细