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核酸的制备与鉴定项目报告 项目名称：核酸的制备与鉴定 班级：10食品 组员：柴鲜鲜，王锦，安艳松，蒋玉丹 项目实验时间：2011.09.21 核酸的提取 一· 背景知识 1·概念 核酸是由核苷酸聚合而成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。最早由米歇尔于1868年在脓细胞中发现和分离出来。广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。核酸由碳、氢、氧、氮、磷5种元素组成。基本组成成分是磷酸、戊糖和碱基。 2·种类 按组成成分戊糖不同分为脱氧核糖核酸（DNA）replication）是指以原来DNA分子为模板，合成出相同DNA分子的过程；转录（transcription）是以DNA分子为模板合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA的过程；翻译（translation）是在由rRNA和蛋白质组成的核糖核蛋白体（简称核糖体）上，以mRNA为模板，根据每3个相邻核苷酸决定一种氨基酸的三联体密码规则，由tRNA运送活化的氨基酸，GTP提供所需能量，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链的过程。 4·应用 现已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构有关。如人类镰刀形血红细胞贫血症是由于患者的血红蛋白分子中一个氨基酸的遗传密码发生了改变，白化病患者则是DNA分子上缺乏产生促黑色素生成的酷氨酸酶的基因所致。肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。70年代以来兴起的遗传工程，使人们可用人工方法改组DNA从而有可能创造出新型的生物品种。如应用遗传工程方法已能使大肠杆菌长生胰岛素，干扰素等珍贵的生化药物。 二：项目实施 实验目的 熟练掌握核酸的性质及应用。 掌握核酸分离提纯以及含量测定的方法。 核酸的提取方法 方法一：稀碱法利用细胞壁在稀碱条件下溶解，使释放出来，这种方法提取时间短，但在稀碱条件下不稳定，容易被碱分解。 方法二：浓盐法利用RN和DN在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DN粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95％乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. ??? 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RN,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.阴离子去污剂法: ??? 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA .由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA. 苯酚抽提法: ??? 苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。水抽提法: ??? 利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积95％乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66％;80％和95％乙醇以及丙铜洗0.2mL（×1）,2.0mL（×1）, 1mL（×4）; 量筒10 mL（×1）, 50mL（×1）; 滴管；水浴锅；离心机。 0.04M NaOH溶液；95%乙醇；1.5M硫酸；浓氨水；0.1M硝酸银。 酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl。 三氯化铁浓盐溶液：将2mL 10％三氯化铁（FeCl3· 6H2O）溶液加入400mL浓HCl。 苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于95％乙醇100mL。 定磷试剂： 17％硫酸：将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中； 2.5％鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100mL水中； 10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL 水，棕色并保存溶液； 临用时将三种溶液和水按下列比例混合： 17％硫酸：2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）。 干酵母粉 4·提取RNA具体步骤 (1)称5g干酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。 (2)悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。3000转/分。 （3）离心15分钟后，将上清慢慢倾入10mL酸性乙醇，边加边搅动。 （4）加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。 （5）用95％乙