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第二章 细胞生物学研究方法 细胞生物学研究的基本技术方法： 形态结构观察 生化分析 生理检测 实验性操作技术 第一节 细胞形态结构的观察方法 光学显微镜（light microscope ） 电子显微镜（electron microscope） 扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope）: 显示晶体表面的原子布阵。 一、光学显微镜 （一）普通光学显微镜 普通显微镜由聚光器、物镜和目镜三部分组成。 普通显微镜最大放大倍数约为1000倍，因为它的分辨率有限（分辨率极限是0.2μm ）。 影响显微镜成像的最关键因素是显微镜的分辨率。 分辨率（resolution）D代表分辨力：D= 0.61( / N.A. (代表光波波长；N. A. 为镜口率，也称数值孔径（Numerical aperture)。 N. A. =n ( Sin ( /2 n： (：镜口角（聚光焦点对物镜镜口的张角，180o） 结论： 通过公式可知要大幅提高分辨率需减小( （限制显微镜分辨率的关键因素） 普通光学显微镜的几个特点： 介质折射率越接近镜头玻璃分辨率越高。 sin α /2的最大值小于1； 普通光线的波长为400~700nm，光镜分辨力约为0.2μm，人眼的分辨力约为0.2mm, 因此普通光学显微镜的最大有效放大倍数为?倍。 （二）紫外线显微镜（ultraviolet microscope） 400nm与x射线之间）为光源，分辨率可提高一倍。 可看到在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。 可用来测定细胞中的核酸含量。 透镜：石英、萤石（CaF2)、 价格昂贵，使用受限。 （三）荧光显微镜（fluorescent microscope） 20世纪40年代在紫外线显微镜基础上发明。 荧光显微镜利用一个高发光频率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光（如紫外光365nm或蓝紫光420nm） 敏感性高，主要用于细胞结构和化学成分等的研究。 结构：在普通光学显微镜上添加一些附件，主要有： A.光源：通常采用超高压汞灯或氙灯，由它发出各种波长的光。 B.滤片：根据性能分为两组。 一组是激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色），作用是仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其它光都吸收掉。 二是阻断滤片，安装在物镜后，作用是吸收和阻挡激发光进入目镜，以免干扰荧光和刺伤眼睛；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。 （四）暗视野显微镜（dark field microscope） 特点：视野的背景是暗的，样品的边缘是亮的。 特殊装置：在聚光器中加装中央遮光板或者使用暗视野光阑 能见到小至5nm的质点，分辨率比普通显微镜高40倍。有些细胞器如核、线粒体亦可见。 能够看到正在运动的微小物体（如精子），也能看到不运动的及某些不能被染色的脂粒，因而常用于微生物与胶体化学研究。 （五）相差显微镜（phase contrast microscope） P．Zernike（荷兰物理学家）于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 原理：将透过标本的可见光的光程差（也就是相位差）变成光强差（即振幅差），从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 例如：当同一束光分别经过1cm厚的水和玻璃时，由于水和玻璃折射率不同，通过它们的光波在相位上会产生一定的差异。因为玻璃的密度和折射率比水大，所以，光波的波长和振幅都减小，通过玻璃的光波的相位落后，由此产生了相位差。 构造上：聚光镜下安装环状光阑；在物镜里装有环形相板，使通过的光线产生一定的相位差。 光阑的作用：使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。 光线透过标本发生衍射，偏离了未透过标本的光线线路，波长延迟1/4 (。 相板作用：相板上有一环形区制成凹槽或凸起，其深度可使通过此区的光线提前或延迟1/4 (。 环形光阑和环形相板必须匹配，通常相差显微镜在物镜上标有”phase”字样，而且也有10(，20(，40(，100(等不同倍数，不同倍数的相差显微镜要用相应的环形光阑，因此，环形光阑也有 10(，20(，40(，100(等不同直径的，装配在一个旋转盘中，按需要调换使用。 透过标本的光线与未透过标本的光线相遇，会产生干涉现象，这时： 如果两者相位相同，则两束光合光的振幅加大