基因工程操作步骤.pptVIP

1.2 基因工程的基本操作程序 基因工程基本操作的四个步骤 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 1、目的基因： 2、获取目的基因的常用方法： （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成 a、从基因文库中获取 (1)基因文库： (2)种类 基因组文库：含有一种生物的全部基因 部分基因文库：只包含一种生物的一部分基因 如：cDNA文库 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库 基因组文库与部分基因文库的关系 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢? ( 3 ) 基因文库的构建 ① 基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 用适当 限制酶切割 许 多DNA片段 与载体连接 导入受体菌群 该生物 基因组文库 （每个受体菌含有一段不同的DNA片段） ② cDNA文库的构建 与载体连接 导入受体菌群 mRNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 双链DNA (cDNA) 该生物 cDNA文库 （1)概念：PCR全称为 _______________，是一项在 生物 ____ 复制___________ 的核酸合成技术通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因 。 多聚酶链式反应 体外 特定DNA片段 (2)原理： DNA复制 b、利用PCR技术扩增目的基因 (3)前提: 要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。 (4)条件 模板DNA( 需含有目的基因 ) 四种脱氧核苷酸(dNTP–- dATP dGTP dTTP dCTP ) 热稳定DNA聚合酶 (Taq酶） 温度控制 引物 (5)过程：变性、复性、延伸 （多次重复） 变性 复性 延伸 可获取大量目的基因 PCR技术扩增过程 a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成_______ b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的______________________延伸，合成与模板互补的________。 氢键 单链DNA 双链 DNA链 5′端→3′端 C、人工合成法 （1)化学合成法 DNA合成仪 蛋白质的氨基酸顺序 mRNA的 核苷酸 序列 基因的核苷酸序列 目的基因 推测 推测 合成 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。 _______ (2)反转录法 目的基因的mRNA 逆转录酶 目的基因 DNA合成仪 不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质的序列。 能转录为相应的信使RNA，能编码蛋白质的序列 编码区： 非编码区： 非编码区 非编码区 编码区 启动子 终止子 （调控序列） RNA聚酶 结合位点 原核细胞的基因结构 编码区上游 编码区下游 编码区 非编码区 非编码区 内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列 能转录为信使RNA ，不能够编码蛋白质的序列 启动子 终止子 内含子： 外显子： 真核细胞的基因结构 非编码区 非编码区 编码区 与RNA聚合酶结合位点 外显子 内含子 1 2 3 4 5 转 录 mRNA前体 成熟mRNA 加 工 原核细胞 真核细胞 不同点 编码区是 _____的 编码区是间隔的、_____的 相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的 原核细胞与真核细胞的基因结构比较 思考 编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？ 连续 不连续 编码区 非编码 (二)表达载体的组成 目的基因 启动子 终止子 标记基因 （一）构建基因表达载体的目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用 二、 基因表达载体的构建 .用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 .用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 .将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 (三) 过程 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程