HPLC的方法及原理.pptVIP

High Performance Liquid Chromatography(HPLC) 2006 05 23 高效液相色谱 早期的液相色谱是采用直径为1-5cm，长度50-500cm的玻璃柱进行的 早期液相色谱的柱流速很低，导致了长分析时间。 在90年代后，由于采用了高压输液系统及高效的色谱柱，使得液相技术得到了很大的发展。 HPCL是高效液相色谱的英文缩写。 HPLC的应用 能被用来进行物质的准确定量分析。 适合分离非挥发性物质。 能分析热不稳定性物质。 通常HPLC能分析的物质有： Amino acids 氨基酸 Proteins 蛋白质 Nucleic acids 核酸 Hydrocarbons 碳氢化合物 Carbohydrates 糖类 Drugs 药物 Terpenoids 类萜烯 Pesticides 杀虫剂 Antibiotics 抗生素 Steroids 类固醇 Metal-organic species 金属有机物 A variety of inorganic substances. 各种无机化合物 HPLC的分类 吸附色谱 adsorption chromatography 分配色谱 partition chromatography 离子色谱 ion chromatography 分子排阻色谱 size exclusion chromatography 亲和色谱 affinity chromatography 吸附色谱的分离机理 分配色谱的分离机理 色谱的固定相 Normal vs. Reversed Phase Chromatography 分子排阻色谱的分离机理 可以分为 凝胶过滤 (gel filtration) 凝胶渗透 (gel permeation) Gel Filtration Chromatography: 流动相：为一般水溶液 固定相：为软质胶体，Agarose (sepharose)﹑Dextran (sephadex) ﹑Polyacrylamide Gel Permeation Chromatography: 流动相：为一般有机溶剂 固定相：为硬质胶体，Cross-linked polystyrene﹑Alkylate dextran﹑Controlled-porosity glass beads. SEC的校正曲线 典型的HPLC系统 往复泵 检测器的种类 通用型 示差折光 Refractive Index (RI) detectors 蒸发光散射 Evaporative Light Scattering detectors 特殊型 紫外－可见光 Ultraviolet-visible light detectors (UV-Vis) 荧光检测器 Fluorescent detectors 电化学检测器 Electrochemical detectors 电导检测器 Conductivity detectors 紫外可见检测器 HPLC的理论公式 HPLC 的保留参数 主要参数, VR 保留体积, 与柱类型有关。 Vo 是死体积, 柱中液相的体积。 k’ 是容量因子。 死体积 容量因子 选择性因子 柱效参数 VAN DEEMTER 方程 HETP = H = A + B/? + C? A - Multipath effect (Eddy diffusion) B/? - Longitudinal diffusion C? - Mass transfer term 多路效应 (涡流扩散) 纵向扩散 质的转移不平衡 分离度 HPLC的方法开发 第一步 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献，如CA(化学文摘) 仪器制造商的文献 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品 分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 分离时要了解哪方面的情况？ 要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成? 方法开发的其他因素 流速对柱效的影响 不同内径的色谱柱有自己的最佳流速 样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对