第三章荧光分光光度法课题.pptVIP

外转换 （external conversion)：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间窜越(intersystem crossing)：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程；分子由激发单重态跨越到激发三重态。 1. 光源 荧光计：汞灯、卤钨灯 荧光分光光度计：氙灯 可调谐染料激光器:功率大，单色性好，热能低 实践中不使用很强的光源的原因： 1）温度升高，降低荧光强度； 2）容易使样品分解； 3）产生大量的臭氧。 2.分光系统 滤光片荧光计：滤光片（激发滤光片、发射滤光片） 滤光片的种类： 1.截止滤光片：用作发射单色器 2.带通滤光片：用作激发单色器 3.干涉滤光片：用作激发单色器 滤光片－单色器荧光计：发射滤光片用光栅代替 荧光分光光度计：光栅 3.样品池 用石英材料制成 4.检测器 光电倍增管、光电二极管阵列式检测器 5.显示系统 二、荧光分析仪器的类型 1.荧光光度计 滤光片荧光光度计：不能测定光谱，用于定量分析。 滤光片－单色器荧光光度计：可以测定荧光光谱。 优点：结构简单、价廉、灵敏度高。 2.荧光分光光度计 测定激发光谱和荧光光谱; 可以同时测定两种或两种以上共存的荧光物质。 SK-2003A型荧光光谱仪(国内首创） RF-5400荧光光度计 Hitachi(日立)F-2500荧光分光光度 荧光分光光度计(澳大利亚) 第三节 定性和定量分析 1.对比法 2.荧光效率、荧光寿命、荧光偏振等参数 一、定性分析 荧光寿命(fluorescence lift time)：当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间。 二、定量分析 优点 1.灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.001?g/mL 2.选择性强 既可依据发射光谱特征，又可根据激发光谱特征； 3.试样量少和方法简单 缺点 应用范围小 1.标准曲线法 C IF 标准曲线 CX IFX 步骤： 1.配制不同浓度的标准 溶液 2.做IF～C关系曲线 3.求得浓度 注意：固定仪器和测定条件 2.直接比较法 注意：样品与标样溶液浓度接近，在线性范围内 步骤： 1.配制标准溶液和试样溶液 2.测IF 3.求浓度 3.联立方程式法 两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定 分别在各自的?荧波长处测定,求出它们的含量。 两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有显著区 别,在某一激发光下一个组分产生荧光峰,另一组分不产生荧光;选用不同的激发光进行测定。 如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰 利用荧光强度的加和性（F=F1+F2+F3+ ），在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解。 第四节 荧光新技术和应用示例 1.时间分辨荧光分析 利用不同物质的荧光寿命不同，在激发和检测之间延缓的时间不同，实现分别检测的目的。 一、荧光新技术 普通的荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异，克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，检测器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达检测器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。 因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的关键。解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在，但是普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy)的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。 2.三维荧光分析 三维荧光光谱是三维图谱，X轴是激发光波长，Y轴是发射光（荧光）波长，Z轴是荧光强度。 优点： 获得完整的光谱信息 多组分混合物的定性、定量分析 采用同步扫描方式获得原始数据，获得三维荧光光谱 3.核酸分子荧光探针 遗传物质的脱氧核糖酸 (DNA), 自身的荧光效率很低，一般条件下几乎检测不到DNA的荧光，因此，常选用某些荧光分子作为探针，通过探针标记分子的荧光变化来研究 DNA 与小分子及药物的作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新的高效低毒药物。目前,典型的荧光探针分子为溴化乙锭，此外也使用锭的配合物等。在基因检测方面，已逐步使用荧光染料作为标记物来代替同位素标记，从而克服了同位素标记物产生的污染,价格昂贵及难保存等的不足。 分子式：C21H20BrN3 英文名：Ethidium bromide 分子量： 394.