包涵体蛋白质复性-纯化课件.pptVIP

大肠杆菌包涵体表达 (His)6 融合蛋白的扩增，纯化和复性 E.g2: 过程 * 细胞培养 收获细胞 细胞破碎 离心 5 - 10 000g 沉淀物 冲洗和离心 分离包涵体 HiTrap? Chelating ＋ Ni2+ 纯化和复性 溶解 包涵体 - 细胞破碎, 冲洗和分离 每 100 ml 培养液重新悬浮细胞沉淀物於 4 ml 20 mM Tris? -HCl pH 8.0 在冰浴情况下，用超声震荡破碎细胞，并在+4oC下高速离心 10 分钟 重新悬浮细胞沉淀物於 2 ml 含 e.g. urea 的冲洗缓冲液和再度超声震荡 并在+4oC下高速离心 10 分钟 用冲洗缓冲液冲洗细胞沉淀物 * 2 M UREA 20 mM Tris HCl 2% Triton X100 0.5 M NaCl 溶解和准备样品 重新悬浮细胞沉淀物於 5 ml 溶解缓冲液 (e.g.): 20 mM Tris? -HCl, 0.5 M NaCl,5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇pH 8 * 在室温等 30-60 分钟 在+4oC 离心 15 分钟 用 0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜过滤 准备 HiTrap? Chelating 柱 冲洗 5 ml H2O 加 0.5 ml 0.5 M NiSO4 冲洗 5 ml H2O 用 5-10 ml 20 mM Tris? -HCl, 5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯基乙醇pH 8 结合缓冲液洗柱 * 最多 5 分钟 纯化和复性 * 稀释样品, 用 10 ml 结合缓冲液洗柱，5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍, pH 8.0上样，并以 20 mM咪唑, 6 M 尿素 pH 8.0 缓冲液洗柱 复性 线性梯度：~ 6 to 0 M 尿素  最少 30 柱体积 流速： 0.1 ml/min - 1 ml/min 用没有尿素缓冲液冲洗 5 个柱体积 纯化和洗脱 线性梯度: 20 mM - 500 mM 咪唑 10 - 20柱体积 用 HiTrap Desalting 交换缓冲液去除咪唑 1.0 0.75 0.5 0.25 0 10 20 30 40 50 60 65 ml Manually using a syringe: ? Sample loading ? Gua-HCl wash ? Urea wash Start elution fr. 38 fr. 42 fr. 46 fr. 49 fr. 40 Start refold- ing A 280 组份分析 * 1: LMW 2: 样品 3-6: 盐酸胍冲洗物 7, 8: 尿素冲洗物 1: LMW 2-6: 组份 38-42 7,8: 组份 48, 49 1.0 0.75 0.5 0.25 0 5 10 15 20 ml A 280 kD94 6743 30 20.1 14.4 1 2 3 4 5 6 7 8 kD94 6743 30 20.1 14.4 1 2 3 4 5 6 7 8 Superdex? 75 HR 10/30 SDS PAGE PhastGel? Gradient 10–15 样品稀释前处理 :　 用 15% SDS, 30% 2-巯基乙醇 +10 mM Tris+1 mM EDTA稀释1:5 HiTrap Chelating 1 ml Superdex 75 HR 10/30 文章 信息 体内，蛋白折叠错误，引发疾病。如：帕金森、疯牛病等。 蛋白折叠理论也是蛋白质组学中的重要研究领域。 阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。AD的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。 * * * * rhGM-CSF = recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, pI = 5.4, molecular mass 14605 produced as inclusion bodies in E.coli cells purified to homogeneity, overall purificati