基因工程 第二章(2009.3)课件.pptVIP

第二章 工具酶 第一节 限制性内切酶 基因的重组与分离，涉及到一系列相互关连的酶催化反应,特别是核酸内切限制酶(restrictionendonucleases)和DNA连接酶(1igase)的发现与应用，才真正使DNA分子的体外切割与连接成为可能。 一、寄主限制与修饰体系（R/M体系） 20世纪60年 W.Arber、H.Smith 和D.Nathans 等首先发现,为此获得了1978年诺贝尔生物医学奖 R/M定义： R/M中的限制作用（restriction)是指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA（外源DNA）导致噬菌体寄主幅度受到限制的现象 R/M中的修饰作用(modification)是指寄主本身的DNA由于合成后通过甲基化作用得以甲基化，使DNA获得修饰，从而避免遭自身限制酶的破坏 限制与修饰与三个连锁基因有关 hsd R编码限制性核酸内切酶 hsd M编码产物是DNA甲基化酶 hsd S表达产物的功能则是协助上述两种酶识别特殊的作用位点。 寄主的限制与修饰有两个方面的作用 1、保护自身的DNA不受限制， 2、破坏外源DNA使之迅速降解。 细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身 DNA 与外源 DNA 的。 二、限制性内切酶(RE) 1、 Ⅱ类RE （1）.命名 主要内容是: ①基本名称 有机体属名的第一个字母 ( 大写 ) 和种名的前两个字母 ( 小写 ), 组成酶的 ②菌株 第一个字母加在基本名称之后 ; 大写字母表示酶的编码基因为染色体外遗传成分。 ③发现次序 罗马数字表示 ④系统名称 RE为R, 甲基化酶为 M ,通常省略 例如 R-HindIII表示限制性核酸内切酶 , 相应的甲基化酶用 M- HindIII 表示。 但在实际应用中 , 尤其是在上下文已交代得很清楚时 , 限制性内切酶的系统名称 R 常被省略。 2.识别序列 A 一般识别序列为4-8bp，大部分为双重旋转对称的回纹结构，即一条5’- 3’与另一条为3’- 5’的碱基相同 B 在某些5或6bp的识别序列中，存在内部简并或外部简并。 EcoR Ⅱ 可切割 CAGG CCGG 内部简并 CTGG XhoⅡ 可切割 R GATCY 外部简并 Y ： T或 C R ：A或G 简并不影响内切酶和甲基化酶的活性，增加了目标序列的频率 C 同裂酶isoschizomers)指来自不同有机体，识别切割相同序列的一组酶 切割位置相同 Hind III 和 Hsa I 均 A AGCTT 切割位置不同 Xma I C CCGGG Sma I CCC GGG 甲基化影响同裂酶是否切割 Msp I Hpa Ⅱ 为同裂酶 当识别序列CC＊GG的第二个C甲基化后 Hpa Ⅱ就不能切割了 D 同尾酶 同尾酶（isocaudamer）来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。 BamHⅠ G↓ GATC, BclⅠ T ↓ GATC， BglⅡ A↓GATC, Sau3AⅠ ↓ GATC XhoⅡ R↓ GATC 就是一组同尾酶 由同尾酶所产生的DNA片段可通过粘性末端之间的互补作用而连接。在基因克隆中很有用。 3. Ⅱ类限制性内切酶的切割方式及意义 （1）三种切割方式 A 从识别序列中间切开产生平末端（blunt end) C 从5’-3’链上对称轴右方切开和3’-5’链上对称轴 左方切开形成具有凸出的3’羟基基团的粘性末端 有些限制性核酸内切酶的识别序列为间断型回文结构 , 酶的切点定位于核昔酸 N 中 , Bgl I(GCCNNNN ↓ NGGC