基因工程原理第七章课件.pptVIP

第七章  动物细胞基因操作 第一节 动物细胞DNA转移技术 动物细胞基因转移的途径=转基因技术 直接DNA转移：外源DNA通过物理转化直接进入细胞 如显微注射、含DNA颗粒轰击、 转染：化学转染技术、脂质体、电穿孔 转导：通过动物病毒包裹，利用病毒可以自然感染细胞并将自身核酸分子转入细胞的能力。 转染技术 化学转染技术(利用胞吞作用) 1) DNA/磷酸钙共沉淀法 适用于单层生长细胞，不适用于悬浮或成团生长的细胞 对某些细胞有毒性，难以转染 2) 二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran) 可溶性聚阳离子制剂，不能用于形成稳定的细胞系 脂质体(利用胞吞作用) 低毒性，易操作，效率高，适用细胞类型多，甚至可转染活体细胞 电穿孔(利用电脉冲在细胞膜上形成瞬时的纳米大小的孔） 转移后DNA的命运 具备在宿主细胞内发挥功能的复制起始子，可以稳定复制(稳定转染) 可以整合到基因组DNA上，稳定复制(稳定转染) 不具备在宿主细胞内发挥功能，也没有整合到基因组DNA上，瞬时保留(瞬时转染） DNA转入细胞的效率远高于DNA整合的效率 两个物理上不相连的基因可以发生共转染，甚至可以都整合到基因组DNA上 第二节  动物细胞载体 动物细胞载体 非复制型载体 瞬时转染的载体(启动子功能分析的载体) 选择标记DNA 带有病毒复制子的质粒 SV40、BPV、EBV 病毒转导载体 腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、Lentivirus等 瞬时转染的非复制型载体 载体无法复制，也不整合于基因组上 在宿主细胞中往往只能保持1-2d的稳定 可以进行基因的表达 载体上往往具有报告基因，能够报告表达的发生 启动子功能分析与报告基因 选择标记基因 未经克隆的含TK基因的外源DNA使一些摄入细胞具有了在选择培养基上生存的能力，这样的基因称为选择性标记基因 两个物理上不相连的基因通过共转染，共同整合到基因组中的现象 这是由于发生了整合之前的DNA融合 只要能同时转入一个选择标记基因，共转化现象就可以使任何外源DNA序列稳定转入哺乳动物细胞 根据标记基因筛选方法，选择标记可以分为：内源性选择标记、显性选择标记、扩增选择标记 来自于动物细胞内的标记基因，大多数涉及与冗余内源核苷酸生物合成途径 内源性选择标记的缺点：只能用于那些对应基因不具有功能的突变细胞。 显性选择标记：往往来自于细菌(外源)，因此其所提供的表型对于细胞来说是全新的，可用于任何细胞。这些标记通常是细菌的抗药基因，因此阳性细胞可以在适当的药物浓度的培养基上进行筛选。 当动物细胞暴露在某种药物的有毒浓度中，少数个别细胞由于自发的、扩增性的抗药突变而存活，这样的DNA上的扩增性标记，称为扩增选择标记 出现扩增选择性标记的细胞栽种群中是随机出现的，可进行高浓度抗药性的筛选 侧翼DNA序列可随标记基因一起扩增 扩增选择标记也常可用于内源或显性选择标记，但常常用于扩增选择的药物不同 病毒基因组具有在宿主细胞内独立复制的能力 可能造成溶解性感染，使宿主细胞裂解，如SV40，由于宿主细胞的裂解，实现的是一种高水平瞬时表达 可能造成潜伏性感染，从而并不影响宿主细胞生长，实现稳定转染，如EBV和PBV，其中EBV载体相对于PBV载体复制更加稳定 外源DNA分子包入病毒粒子(通过连接或同源重组的方式插入病毒载体），后者吸附到细胞表面从而进入细胞 效率很高，而且具有高效复制与高水平表达基因的潜能 不仅可用于培养细胞，也可用于活体细胞 腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、Lentivirus等 当转移基因插入到基因组中或它所替换的基因对于在宿主细胞中的感染周期不是必需时，载体可以独立的增殖，称为可复制的或不依赖辅助病毒载体。 当转入基因替换了病毒的必需基因时，这样的载体则称为复制缺陷型或辅助病毒依赖性载体。因为它们失去的功能需要通过共转入携带有载体所缺失基因的辅助病毒来提供。 不具有所有病毒编码序列的载体，只含有包装和基因组扩增所必需的顺式作用元件。 优点: 1) 可容纳高容量的外源DNA 2) 不产生病毒基因产物，对细胞无毒性 第三节 细胞与应用 第四节  动物基因操作 产生转基因哺乳动物的方法 体细胞-卵细胞核替换 显微注射受精卵 反病毒侵染胚胎干细胞或早期胚 转基因小鼠 大多数动物细胞在发育能力上受到限制，不能产生转基因动物：分化的细胞无法完全去分化和重复发育 动物中实现生殖细胞系转化的唯一途径就是在形成生殖细胞系的发育阶段之前把DNA导入全能细胞 胚胎干细胞(Es Cells)是这样一个动物体特殊的全能细胞 转基因小鼠中的DNA转移方法 直接显微注射：注入刚受精卵细胞的雄或雌性原核中 重组反转录病毒：