基因工程的基本技术课件.pptVIP

? 2、 PCR反应过程： 变性：DNA双链变为单链； 退火：引物与模板结合； 延伸：合成互补链； 上述过程通过PCR仪的程序设计及自动运作完成。 ? 3、 PCR反应体系： 体系成分：模板DNA、引物、Taq酶(热稳定性)、 dNTP、反应缓冲液（Mg2+ 、 BSA、Tween20、DTT 、 Tris.cl ） 。 1）、引物（寡聚核苷酸） §一般成对出现，长度为15-30个核苷酸； § 使用浓度： 0.1-0.5uM，高达1uM； § 引物设计原则： 1、G+C含量45-55%； 2、Tm值高于55； 3、引物特异性； 4、引物扩增跨度； 5、是否形成引物二聚体 2）、模板DNA： §基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段； §质量要求：不高 3）、Taq酶(热稳定性)： §常规酶 §高保真酶：ExTaq §La Taq酶 4）、反应缓冲液成分： § BSA、Tween20、DTT、明胶----保护酶作用 § Tris.cl提供缓冲作用 §(2)、 dNTP的浓度： 常用100-200μmol/L，不能低于20μmol/L，特异性、保真性； ? 4、影响PCR 产量、质量的因素： §(1)、 Taq酶：常用1U/25μL ?浓度低，扩增产物不够； ?浓度高，非特异性扩增增加； ?酶的活性； §(3)、模板：主要考虑纯度及使用量 对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng. §(4)、引物浓度： 0.1-0.5μmol/L之间，过多则非特异扩增增加，形成引物二聚体； §(5)、 Mg2+浓度：常用 0.5-2.5mmol/L； 影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性 §(6)、 PCR反应程序设定： (1)、变性温度和时间： 要求变性彻底，但要考虑酶的半衰期：92.5℃ （2小时）95℃ （40min）97℃ （5min）94℃变性比较彻底，酶的半衰期也不短。 (2)、引物退火温度Tm与时间； Tm值由引物ATGC数决定每A、T计为2℃， G、C计为4℃，时间一般为40秒到60秒 (3)、 引物延伸温度与时间： 72℃最佳，30-100nt/s，也有用68 ℃如La Taq (4)、循环数： 25-35 cycles 之间，过多则非特异扩增增加；平台效应； 以普通PCR 50?l reaction solution 为例) 10?PCR buffer 25mM MgCl2 dNTP Mixture (10mM each) primer 1 （10 ?M) primer 2 (10 ?M) Taq polymerase (5U/ ?l) DNA template (0.1 ?g/ ?l) ddH2O total 5 ?l (1?) 4 ?l (2mM) 1 ?l(0.1mM) 1 ?l(0.2 ?M) 1 ?l(0.2 ?M) 0.6 ?l(2U/50 ?l) 1 ?l 36.5 ?l 50 ?l 5、PCR例子（Example of reaction solution） §反应体系配置： § PCR thermal program 94?C 94 ?C Tm 72 ?C 72 ?C 4 ?C 1min 30sec 30sec 1min 5 ?C endless 30 cycles 循环数 Heat denaturation Heat denature Primers annealing Extension Last extension Ending reaction Ta: annealing temperature 设计的反应程序 相应作用 6、PCR的种类 RT-PCR 特异PCR 锚定PCR 反向PCR 套式PCR 不对称PCR 长程PCR 锅柄PCR 免疫PCR RAPD 定量PCR 原位PCR F R ?（1）特异PCR 扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特定的。 ? （2）RT-PCR： 是一类以mRNA为最初模板的基因的扩增。 A A A A A A A A A A 5`CAP T T T T T T T T T T T ?（3）反向PCR： 根据已知序列扩增两侧序列的方法。 已知序列 未知序列 未知序列 酶