生物技术大实验课件.pptVIP

生物技术大实验 实验目的 掌握cDNA克隆的基本技术，主要包括引物设计、核酸提取纯化、 PCR扩增、核酸电泳、细菌转化、蓝白斑筛选、核酸序列分析等。 实验内容 实验一、目的基因的引物设计 实验二、总RNA的提取 实验三、cDNA合成 实验四、PCR扩增 实验五、PCR产物回收纯化 实验内容 实验六、连接反应 实验七、细菌转化 实验八、蓝白斑筛选 实验九、PCR检测阳性克隆 实验十、测序及序列分析 实验安排 第14周：指导学生熟悉cDNA克隆的整个过程 5月23日 理论讲解；实验室安全教育；溶液和培养基的配制；刀具灭菌； 5月24日 总RNA提取及电泳检测 5月25日 cDNA合成和PCR扩增 5月26日 产物回收纯化、连接反应、细菌转化 5月27日 蓝白斑筛选和阳性克隆检测，送测序 第15-16周：开放实验室，每小组选择目的基因，自行设计引物（需在第13周完成），然后完成所选目的基因的cDNA克隆。 实验要求 1、分组实验，每小组选1小组长，负责整个小组的实验安排，各组员均需积极参与实验。最后以小组为单位进行考核，即以各小组实际的实验结果进行评分，不另外安排考试。 2、实验结果主要包括：总RNA电泳图、内参基因检测cDNA的电泳图、PCR电泳图、胶回收电泳图、平板的蓝白斑图、PCR检测阳性克隆的电泳图，每人交1份实验报告，实验报告需要对自己的实验结果进行深入的分析和讨论。 3、整个大实验期间，全体同学需严格遵守各个实验的规章制度，确保水、电安全，同时在实验期间要严格遵守操作规范，确保人身安全。  设计引物 提取总RNA 反转录成cDNA PCR扩增 目的片段回收 目的片段插入载体 重组DNA转化大肠杆菌 筛选阳性克隆 测序 序列分析 实验一、引物设计 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 引物设计是否合理直接影响目的基因的克隆 引物设计的原则 ①引物长度：一般为15-30个碱基，常为20个碱基，太长会影响扩增效率，太短又会影响扩增的特异性。 ②引物退火温度：上、下游引物的退火温度不能相差太大 在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃ 在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃ ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜, ATGC最好随机分布 ④避免引物内部出现二级结构 避免两引物之间互补，特别是 3`端 ⑤引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基 ⑥引物5’端可以加上合适的酶切位点 方便酶切 引物设计相关软件的介绍 Clustal X：用于寻找不同物种相同基因cDNA序列的同源区 Primer Premer 5：用于寻找最佳的引物，会提供各种引物参数 Clustal X 以克隆黑鲷的NPY基因为例： 在National Center for Biotechnology Information NCBI基因库 中搜索相近物种的NPY cDNA序列 用Clustal X 软件对所搜索到的cDNA进行序列比对 找出高度同源区 在该区设计特异或简并引物 Primer Premer 5 把CLUSTAL X比对好的aln文件导入primer premer 5,按照界面提示，依次点击primer——search——OK——result——选择期望扩增片段大小的引物 每小组自行选择一个感兴趣的目的基因进行引物的设计，要求： 该基因在NCBI geneBank中尚未发表 所选物种必需是我们能获取的材料 学会在NCBI geneBank中搜索相关物种的目的基因序列 学会Clustal X，Primer Primer 5软件的使用 设计出合理的引物2对，供后面使用。 实验二 提取总RNA 原理： 利用Trizol （异硫氰酸胍-苯酚）快速裂解细胞，使RNA从细胞核中释放出来 安全注意事项 DEPC：焦碳酸二乙酯，是强的蛋白变性剂和致癌物。开瓶时要使瓶子尽可能远离操作者，因为内部的压力可能导致飞溅。操作中应戴上手套，并在通风厨中进行； 有机溶剂：RNA提取试剂为有机挥发试剂（硫氰酸胍-苯酚、氯仿、异丙醇），均有毒，需在通风厨操作或屏息操作，少讲话，以免将有毒气体吸入体内。若试剂不小心沾到皮肤上，请立即用自来水冲洗； EB：溴化乙锭，是诱变剂，具有高致癌性，配制使用时，应戴乳胶手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是接触过EB的器皿或物品，必须经特殊处理后，再进行清洗或弃去。 提取RNA注意事项 RNA酶是一种非常稳定的酶，它由一条多肽链组成，变性后易复性，耐热，煮沸能保持大部分的活性，RNA酶活性不依赖任何辅酶，pH值耐受范围很宽。 外源性RNA主要来源于空气以及操作