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第四章 细胞生物学研究技术 细胞生物学概念 细胞生物学（Cell Biology）：是探讨细胞生命现象的发生规律及其本质的科学。 四、微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC） 六、激光共聚焦扫描显微境 （Laser confocal scanning microscope, LCSM） 原理：类似荧光显微镜，用激光作光源，逐 点、逐行、逐面快速扫描。能扫描不同层 次，形成立体图像。 主要用途：组织光学切片 ；三维图像重建 制样技术 1）超薄切片 用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机制作。 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。 扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM 分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。 主要用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。 电子显微镜技术（Electron microscopy） 电子显微镜进展 比尼格和罗雷尔 （1986年获诺贝尔奖） 扫描隧道电子显微镜 1982年发明 电子显微镜技术（Electron microscopy） 扫描隧道电子显微照片 光镜与电镜的区别 第二节 细胞分离与细胞培养 细胞培养（Cell culture） 细胞融合（Cell fusion） 细胞培养（Cell culture） 基本概念 细胞培养的优点 　是指在体外适宜条件下使细胞继续生长、增殖的过程。 容易在较短的时间内获得大量的细胞 有利于研究单一类型的细胞 通过人为控制培养条件，可以减少一些未知的因素影响 氨基酸 ＋ 糖 ＋ 维生素 生长因子 无菌环境、适宜温度，pH值 细胞培养（Cell culture） 细胞培养的条件 培养基（Medium） 血清（Serum） 环境（environment） 所需器械 支持物 体外培养细胞的特性 贴壁生长 多数体外培养细胞需要贴附于玻璃或特殊塑料表面才能生长、分裂，形成单层细胞（single layer cell）的现象。 正常细胞在细胞培养过程中，当细胞生长到相互接触的时候，细胞便停止生长的现象。但肿瘤细胞没有接触抑制现象。 接触抑制 (contact inhibition) 细胞培养（Cell culture） 直接来自于有机体的细胞培养称原代培养。但常常也将第1代与传10代以内的细胞培养统称原代细胞培养。 细胞培养（Cell culture） 原代培养 (Primary culture) 传代培养 (Secondary culture) 将适应了体外条件的原代培养细胞进行传代和扩大培养。 细胞系　(cell line) 有限细胞系　(finite cell line) 永生细胞系　(infinite cell line) 　　指能顺利传40－50代，仍保持正常细胞特点的传代细胞。 指在培养过程中，那些具有无限繁殖能力的，不死的变异细胞，可以无限传代，即具有了癌细胞的特点。 细胞株　(cell strain) 从某一细胞系中，用单细胞克隆培养而形成的，具有基本相同的遗传性状的细胞群体。 细胞融合（Cell fusion） 细胞融合（Cell fusion） 指自发或人工诱导下，两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程 异核体 合核体 细胞融合（Cell fusion） 细胞融合方法（Method for cell fusion） 自然方法 人工诱导 灭活的病毒或化学物质介导 电融合技术 差速离心 (Differential centrifugation) 细胞器和大分子的离心分离 第三节 细胞组分的分析方法 密度梯度离心（Density gradient centrifugation) 匀浆器 超声波 低渗处理 细胞组分的分级分离 离心前预处理 细胞匀浆 机械研磨 过滤 细胞组分的分级分离 差速离心（Differential centrifugation） 特点： 用途： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。 分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 细胞组分的分级分离 差速离心（Differential centrifugation） 低速 高速 细胞组分的分级分离 密度梯度离心（Density gradient centrifugation) 速度沉降（velocity sedimentation ） 平衡沉降（Equilibrium sedimentation） 分离密度相近而大小不等的成分 分离密度不等的颗粒 速度沉降（A） 平衡沉降（B）