琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤.pptVIP

使用EB染色注意事项 （1）EB被认为是一种强致癌物质 （2）EB可用来检测单链或双链核酸 （3）EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。 （4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。 凝胶中DNA的成像 可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。 关于琼脂糖凝胶电泳的实验技巧和方法\几点注意事项 1）加样时枪头不要碰坏凝胶壁，否则DNA的带型将不会整齐，加样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液，以赶走样品空中的气泡。 2）每孔最大DNA上样量决定于DNA样品片段的大小、数目及样品孔形状与容量。 3）应注意每孔最大上样容量及样品孔体积，以免加样时样品流入附近样品孔造成交叉污染，影响结果分析。 4）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可在阳极槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于Southern印迹转移和需要回收DNA片段的电泳，则应该每一个样品用一个枪头加样，避免样品交叉污染。） 5）凝胶中加入EB进行电泳，便于紫外线下观察电泳状态，但EB会导致线形DNA迁移率下降，这在酶切质粒与空白对照质粒一起电泳时应值得注意。 6）电泳过程中，溴化乙锭向负极移动，与DNA泳动的方向相反，较长时间的电泳会造成靠正极方向的凝胶中溴化乙锭含量低，会对含量较少的小分子DNA片段检测困难。处理方法是：将凝胶在0.5ug/ml的EB溶液中染色30－45分钟。 7）判断正负极的另一方法是负极气泡（H2）比正极气泡（O2）多一倍。 琼脂糖凝胶电泳Agarose gel electrophoresis 天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉 是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。 琼脂糖（agarose） 半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷 D-半乳糖 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段 1. 因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2. 对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3. 凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、 核酸、病毒 等大分子物质。 4. 透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6. 样品易回收，常用于制备。 琼脂糖凝胶电泳的优点 缺点 1. 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2. 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3. 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4. 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。 二、实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。 琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。 溴化乙锭（Ethidium Bromide, EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 三、实验材料、器具及药品 质粒DNA样品。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTBE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓冲液 四、实验步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入100μl的0.5mg/ml EB，并摇匀。） ⑵ 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。 ⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。 ⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上，再加入2μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 ⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。 ⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。 ⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。 1 2