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微生物检查方法验证及其影响因素探讨 　　摘要：目的 规范微生物检查方法验证工作，便于人们进行微生物限度和无菌检查工作时参考。方法 微生物检查法方法验证工作错综复杂， 影响因素较多，如培养基、试验步骤以及供试品的制备等。在方法验证过程中， 探讨上述因素对验证结果的影响。结果 本文系统阐述了微生物限度和无菌检查法验证的内容和技术评价要求，对准确检测药品中微生物含量等指标有着非常重要的参考价值和指导意义。结论 微生物检查法方法验证工作较为复杂，阐述了多种供试品的制备途径。 　　关键词：微生物限度；无菌检查；方法验证；影响因素；微生物检测 　　微生物学检查方法包括微生物限度检查法和无菌检查法。微生物限度检查法是检查非规定灭菌制剂及原辅料受微生物污染程度，包括细菌、霉菌等菌种的数目及控制菌检查。无菌检查法是检查药典要求的无菌药品、原辅料等是否无菌。如外用制剂须检查和验证铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌；若制剂含药材原粉等， 还需检查和验证大肠菌群和（或） 沙门菌。通过不同给药途径，因此临床给药途径在微生物限度检查和方法验证中有着举足轻重的地位。 　　1 方法验证的模式及影响因素 　　1.1 培养基的无菌检查及菌株准备 使用时应仔细观察培养基碟子， 检查是否有微生物污染或干燥收缩。经过预培养的培养基按照相应测定的微生物， 选择标准菌株（不超过5代） 试验。控制菌还应设定对照组， 以检测其专属性。 　　1.2 微生物方法验证的内容 　　1.2.1 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证内容 至少进行3次平行试验， 分别计算每次各试验菌的回收率。验证菌株为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、枯草杆菌。验证方法分试验组、菌液组、稀释剂对照组以及供试品对照组，方法如下：试验组：采用平皿法计数时，每株试验菌均制备2个平皿；也可采用薄膜过滤法计数。菌液组：应检测添加的试验菌数。稀释剂对照组：检查供试液制备时，微生物受污染程度，采用薄膜过滤法计算其菌数。供试品对照组：定量取供试液，采用薄膜过滤法计算其供试品本底菌数。无菌检查可采用：①薄膜过滤法：采用微孔滤膜拦截细菌，去除可溶性成分。验证重点：确定滤膜的适用性、冲洗方法以及冲洗液用量。②中和法：中和剂应对微生物无毒性，与抑菌性成分结合后的产物，也应对微生物无毒性。验证重点：确定中和剂有效，并证明对污染微生物无毒性。 　　1.2.2 控制菌检查法的验证内容 控制菌检查包括大肠菌群、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、铜绿假单胞菌和梭菌检查。试验菌株严格按照规定检查的控制菌，选取相应的验证菌株。方法如下：试验组：按照相应控制菌检查法进行检查。采用薄膜过滤法时，添加试验菌应选在最后一次冲洗液后， 过滤后方可注入培养基中。对照组：验证该检查方法的专属性。 　　1.2.3 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证结果判断指标 根据上述试验结果，可计算供试品组的菌回收率、稀释剂对照组的菌回收率。如果任意一次试验中试验组的菌回收率，低于70%，应采用培养基稀释法、薄膜过滤法等方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。 　　1.2.4 控制菌方法验证的结果判断 按《中国药典》2005年版规定，阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。如果试验组检出试验菌，则按照相应方法进行控制菌检查。如果试验组未检出，则需重新验证。控制菌检查还应设有专属性试验。验证试验及结果的判断：①目标菌阳性对照管菌和供试品加目标菌管生长良好；②阴性对照管以及阴性菌对照必须无菌生长。如果上述试验成立，表示可按照该方法进行该品种的控制菌检查。 　　1.3 特殊供试品的制备 由于供试品本身的特性，可能会产生假阴性。在正常生产过程中，利用供试品与微生物的差异，消除供试品对药品中微生物的影响，从而准确检测药品中微生物的真实含量，是较为普遍使用的方法。具体包括：①培养基稀释法：取规定量供试品/供试液，加至培养基中，使单位体积内的供试品浓度稀释至无明显抑菌作用。适用范围：不能使用薄膜过滤法，抑菌活性较弱的样品。验证重点：把握好培养基增加量与供试品/供试液不显抑菌活性的关系。②离心沉淀法：利用沉降系数差异除去药渣以及含抑菌活性的部分。适用范围：不能采用薄膜过滤等方法的样品。验证重点：设置有效离心率，确定能将药渣、抑菌部分除去。③薄膜过滤法：采用微孔滤膜拦截细菌，去除可溶性成分。④中和法：中和剂应对微生物无毒性，与抑菌性成分结合后的产物，也应对微生物无毒性。 　　2 微生物检查方法验证的难点问题 　　人们对药品生产、保存和使用过程中，对于可能出现的微生物污染问题进行了大量的研究考察。很多研究资料表明[1，2]：药品中污染的微生物数量以及微生物种类有不确定性，在药品生产环节中， 微生物污染存在着随机性。因此，为了监控药品生产过程中的微生物污染。所有的