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第九章 动物组织培养 第一节、动物组织培养的基础 一、动物细胞 特点 无细胞壁倍增时间长，生长缓慢需氧量少，对搅拌敏感 (why?)聚集体形成原代细胞培养50代即开始退化 (Hayflick界限) 二、 动物细胞培养定义 动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 是动物细胞工程的基础。 与植物组织培养定义的比较：植物组织培养是指在无菌条件下，在人工培养基上，离体培养植物的器官、组织、细胞以获得再生植株等的过程、方法。 外植体：由活体植物上切取下来进行培养的组织或器官。 动、植物细胞培养与微生物培养区别 动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。 Classification of Cell Cultures Primary CultureCells taken directly from a tissue to a dish Secondary CultureCells taken from a primary culture and passed or divided in vitro.These cells have a limited number of divisions or passages. After the limit, they will undergo apoptosis.Apoptosis is programmed cell death Primary Culture 三个相关定义 细胞系：原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。原代培养后得到细胞系，再经多次传代培养后，一部分细胞死亡，一部分细胞继续生长并转化为连续细胞系或无限细胞系。 3、生长特性 根据形态特征分类A 贴壁型（粘附型细胞） 上皮细胞型、 成纤维细胞型、 游走细胞型、 多形细胞形。 粘附生长 本是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。粘附有两种含义：一是细胞之间相互接触；二是细胞与细胞外基质结合。 动物细胞培养中，大多数哺乳动物细胞是必须附壁即附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长，这时若取走一片细胞，存留在表面上的细胞就会沿着表面生长而重新布满创面。 两种贴壁的培养细胞 Contact inhibition When cells contact each other, they cease their growth.Cells arrest in G0 phase of the cell cycle Transformed cells will continue to proliferate and pile upon each other B 悬浮型 体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫悬浮型细胞。 一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞或微生物，当接种于体外环境中也可以以悬浮状态生长。如：血液白细胞、淋巴组织细胞，某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等都属此类细胞。 这类细胞形态学特点是胞体始终为球形。 第二节、常用的细胞培养方法 一、培养细胞的生存环境1.环境无毒和无菌：2.适宜的温度：人和哺乳动物培养细胞最适温度均为35－37℃。3.气体环境和氢离子浓度：需要一定量的O2（1995－9975pa）和CO2（95％空气+5%CO2）；pH7.2-7.44.渗透压：260－320mOsm/kg适用于大多数细胞5.营养要求苛刻：需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供。六碳糖是主要的能源物质，谷胺酰胺是其主要的氮源之一并对其增殖与生长具有重要作用。 二、动物细胞培养的特殊性 1、大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长。 2、动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需要血清。 3、对于培养环境的适应性更差，对环境极其敏感，包括 pH 、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，一般需严格监控。对环境的