第3章微生物细胞的破碎技术060223.pptVIP

第3章 微生物细胞的破碎 细胞破碎定义 2 细胞壁的组成和结构 2.1细胞壁的组成和破碎阻力 2.2.细胞壁的结构 细菌的细胞壁 酵母菌的细胞壁 真菌的细胞壁 3 微生物细胞的破碎技术 3.1微生物细胞的破碎技术 细胞破碎主要方法 细胞破碎机理 细胞破碎机理图 机械破碎法与非机械法比较 破碎技术的未来发展方向 破碎方法选择原则 3.2 常用的破碎技术： 1）机械破碎法 研磨法： 珠磨法： 组织捣碎法： 高压匀浆器 X-press法（高压挤压法） 撞击破碎法： 超声波法 2）非机械方法 酶解法 自溶法 特点：采用抑制细胞壁合成的方法能导致类似于酶解的结果。某些抗生素如青霉素或环丝氨酸，能阻止新细胞壁物质的合成。抑制剂应在发酵过程细胞生长期的后期加入、只有当抑制剂加入后，生物合成和再生还在继续进行，溶胞的条件才是有利的。这样在细胞分裂阶段存在的细胞壁有缺陷，故能达到溶胞作用。 原理：微生物代谢过程中，大多数均能产生一种水解细胞壁上聚合结构的酶，以使生长过程得以延续，但改变微生物的环境因素（如PH、时间、压强、缓冲液浓度、细胞代谢途径等）可诱发产生过剩的该种酶或激发产生其他自溶酶而达到自溶的目的。 注：因自溶法时间较长，常需要添加少量防腐剂防止细菌滋生和污染。微生物细胞的自溶常采用干燥或加热的方法 渗透压冲击 反复冻结-融化 丙酮干燥法： 表面活性剂法： 干燥法 4 破碎方法的影响因素： 破碎率的测定： 直接测定法 测定释放的蛋白质量或酶的活力 五．包含体的破碎 目标蛋白质凝聚形成包含体后，由于密度较大，易于离心分离，而且能减轻蛋白酶对其的降解作用和其对宿主细胞的毒害作用。但是，包含体的形成为重组蛋白的分离纯化带来很大的困难，常因重组蛋白的变性和复性效率不高，而使目标蛋白的活性和回收率很低。通常包含体中目标蛋白含量很高，有时可占细胞总蛋白的50％以上。 包含体中目标蛋白的制备，包括细胞破碎、包含体的沉淀、包含体的变性溶解和蛋白质的复性等步骤。细胞的破碎常用水解处理和高压破碎方法，细胞破碎后，采用低速离心沉淀包含体，用表面活性剂洗涤去除脂类和膜蛋白，然后用高浓度的变性剂溶解包含体，在变性剂溶液中溶解的蛋白质呈变性状态，但一级结构和共价键未被破坏，去除变性剂后，蛋白质可复性成正确构型。 蛋白质的复性操作主要有两种方法： （1）将溶液稀释，降低变性剂的浓度和降低蛋白质的浓度，使蛋白质复性。该法的缺点是增大了后处理体积。 （2）利用透析、超滤等膜分离技术去除变性剂。该法适用于较高浓度的蛋白质复性。复性的效果取决于蛋白质聚集和正确折叠之间的竞争。为了减轻聚集，复性通常在低浓度（10～100 μg/ml）下进行。 目前，提高目标蛋白质复性效率的对策主要有： （1）加入聚乙二醇等共溶剂，可逆修饰折叠中间体的疏水表面； （2）加入二硫苏糖醇等巯基还原剂，重建二硫键； （3）加入二硫键异构酶与脯氨酸顺反异构体酶，提高重组蛋白质的正确折叠率； （4）添加分子伴侣，提高折叠中间体的缓冲体系，防止肽键的错误折叠； （5）利用疏水作用色谱，离子交换色谱，金属鳌合色谱和凝胶过滤色谱等进行色谱复性。 作业 定义：X-press法是一种改进的高压挤压法，将浓缩的菌体悬浮液冷却至-250至-300 ℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。由于突然减压而引起一种空穴效应，同时由于高速冲击和撞击而引起细胞的破碎。 适用性：微生物细胞，主要用于实验室中。 设备：高压匀浆器，French压榨器等。 优点：适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高，对冷冻-融解敏感的生化物质不适用。 撞击破碎是另一种常用的机械破碎细胞的方法，其原理是将弹性体的细胞进行冷冻，使其成为刚性球体，从而降低破碎的难度，适用于大多数微生物细胞和植物细胞的破碎。具体做法是浓度为 10％～20％的细胞悬浮液以喷雾状高速冻结形成粒径小于50μm的微粒子。高速载气将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。 撞击破碎的特点是：细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，细胞破碎程度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎的现象。细胞破碎程度可通过无级调节载气压力(流速)控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器(如线粒体、叶绿体等)的回收。 定义：采用超声波破碎机在15到25千赫（kHz）的频率下操作，细胞的破碎是由于超声波的空穴作用。这种空穴泡由于又受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。 原理：超声波具高频率，短波长，定向传播等特点。超声波在液体中传播时使液体中某点某瞬间受到巨大的压力